CRISPR/Cas9基因编辑技术综述

钦越 陈志 杨章平

摘要：CRISPR/Cas9首次在细菌中被发现，是适应性免疫系统的一部分，现已广泛用于工程改造基因组中激活或抑制基因表达。同时，CRISPR/Cas9有望通过提供一种有效的技术来剖析癌症发生的机制，确定药物开发的靶标，并可能为基于细胞的疗法提供支撑以加速癌症的研究。对CRISPR/Cas9技术的发展历史和应用范围做了概述及展望，以期为CRISPR/Cas9技术的后续发展提供思路。

关键词：CRISPR/Cas9;基因编辑;哺乳动物

长期以来，基因疗法一直被寄予希望可以治疗或纠正人和动物体内的各种疾病和缺陷。随着簇状规则间隔短回文重复序列（CRISPR）的发现、基于CRISPR的原核生物适应性免疫系统（CRISPR相关系统，Cas）的机制以及它的再利用成为一种有效的基因编辑工具，使得分子生物学领域发生了革命性的变化，并激发了人们对新的和改进的基因治疗的兴趣。CRISPR/Cas9（规律性成簇间隔的短回文重复序列/CRISPR相关蛋白）系统是继ZFN、TALENs等基因编辑技术推出后的第三代基因编辑技术，是现有基因编辑和基因修饰里面效率最高、最简便、成本最低的技术之一，已成为当今最主流的基因编辑系统。

一、CRISPR/Cas9系统的起源

1987年，日本科学家在研究大肠杆菌的时候发现其基因组上有一段29bp的序列反复出现了数次且彼此之间被一段 32bp的序列所隔开。1993年，西班牙科学家Francisco Mojica在地中海噬盐菌中也同样发现了这段重复序列。随着后续的研究，他在二十多种不同的微生物体内都发现了这种重复DNA结构，并将其命名为成簇的规律间隔的短回文重复序列 （Clustered Regulation Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR）。通过对比多种细菌的几千段CRIPSR序列，发现在 CRIPSR序列中存在许多片段与病毒的基因组序列高度一致，虽然不是完整的病毒基因组序列，但这些序列被夹在一段细菌精心设计的重复序列中。进一步的研究证实，这些与病毒基因组高度一致的序列来自于噬菌体。2007年，CRISPR序列对于细菌免疫系统的功能在嗜热链球菌中得以证明。

2011年，美国化学家詹妮弗，杜德纳与法国生物化学家埃马纽埃尔，卡彭蒂耶合作开发CRISPR技术，并于一年后在《Science》杂志中首次指出，CRISPR/Cas9系统在体外实验中能定点对DNA进行切割，显著提升了基因编辑的效率。2013年，哈佛大学医学院教授乔治。彻奇和华人科学家、麻省理工学院教授、博德研究所资深研究员张锋分别相继证明了CRISPR序列与Cas9蛋白结合可以在人类细胞中高效地定位、剪切和修改基因组。

二、CRISPR/Cas9系统的作用机理

CRISPR/Cas9系统主要由Cas9蛋白和单链向导RNA（sgRNA）所组成，其中Cas9蛋白起切割DNA双链的作用，sgRNA起向导的作用，在sgRNA的向导下通过碱基互补配对原则，Cas9蛋白可对不同的靶部位进行切割，实现DNA的双链断裂。

（一）CRISPR高度可变的间隔区的获得

当有外源DNA人侵细胞时，Cas1和Cas2编码的蛋白会对该DNA进行识别，并在过程中寻找到该DNA的PAM区域，CRISPR将以该PAM区域附近的DNA序列作为候选的原型间隔序列。在识别后，Cas1/2蛋白复合物会对选择出的间隔序列进行剪切处理，同时，会有一部分酶将原间隔序列插人到CRISPR序列的前導区下游区域。在通常情况下，断裂的DNA会采用高效的非同源末端连接方式（NHEJ）进行自我修复，将被剪切的双链缺口闭合。经过该阶段，一段新的间隔序列就被添加到了基因组的CRISPR序列之中。

（二）CRIPSR基因座的表达

CRISPR序列的前导区会调控序列转录产生pre-CRIS-PR RNA，tracrRNA（反式激活crRNA）在此时也会被转录出来与pre-crRNA序列进行互补。pre-CRISPR RNA通过碱基互补配对与tracrRNA形成双链RNA并与Cas9编码的蛋白组装成一个复合体。该复合体的目的是根据外源DNA的类型选取不同的间隔序列RNA，并在核糖核酸酶III（RNaseIII）的协助下进行剪切，最终形成一段短小的CRISPR RNA（包含单一种类的间隔序列RNA以及部分重复序列区）。

（三）CRISPR/Cas系统活性的发挥

由CRISPR RNA，Cas9以及tracrRNA组成的复合物将识别整个外源DNA序列，并识别出与crRNA互补的原间隔序列。这时，复合物将定位到PAM/原间隔序列的区域，DNA双链将被解开，形成R一Loop。此时crRNA与互补链相连接，而另一条链则保持游离状态。Cas9蛋白随后会精准的平端切割位点位于PAM上游3个核苷酸的位置，形成平末端产物。Cas9蛋白的HNH结构域负责切割与crRNA互补配对的那一条DNA链，而RuvC结构域负责切割另外一条非互补DNA链。最终在Cas9的作用下DNA双链断裂（DSB），外源DNA的表达被沉默。

三、CRISPR/Cas9系统的应用

（一）基因敲除（Knock-out）

在通常情况下，当细胞出现DNA双链断裂的情况时，会采用高效的非同源末端链接（Non-homologous end join-ing，NHEJ）对断裂的DNA进行修复。但是，在修复过程中通常会发生碱基插人或缺失的错配现象，造成移码突变，使靶标基因失去功能。而CRISPR/Cas9系统可以利用Cas9蛋白对靶基因组进行剪切，形成DNA的双链断裂，进而实现基因敲除。

Zhou等川利用CRISPR/Cas9系统针对山羊成纤维细胞中的BLG位点进行敲除，获得p-乳球蛋白（BLG）基因敲除山羊，通过进一步研究发现在敲除山羊的乳汁中BLG蛋白表达极显著降低，为羊奶的品质优化提供了有效依据。G.N.Singina等利用CRISPR/Cas9系统获得了PAEP和LOC100848610基因敲除的胚胎成纤维细胞系以用于生产不合成p-乳球蛋白的牛的转基因后代。Watanabe等使用CRISPR / Cas9在人胰腺导管腺癌（PDAC）细胞系中敲除 KDM6A，证明KDM6A缺失的细胞表现出侵袭性表型。Yuza等4证实，敲除PAN02细胞中的SphK1基因可以促进细胞的增殖和迁移。利用CRISPR /Cas9技术，Chugh等日将 C1CALT1基因从PDAC细胞中敲除，发现细胞的生长速度、迁移率等指标的表达都有显著提高。在胰腺癌的研究中，也有许多基于CRISPR/Cas9系统的研究，即敲除胰腺癌细胞的特异性基因，然后观察不同表型的变化。

（二）基因敲入（Knock-in）

当DNA双链断裂后，如果有DNA修复模板进人到细胞中，基因组断裂部分会依据修复模板进行同源重组修复（HDR），从而实现基因敲人。修复模板由需要导人的目标基因和靶序列上下游的同源性序列（同源臂）组成，同源臂的长度和位置由编辑序列的大小决定。DNA修复模板可以是线性/双链脱氧核苷酸链，也可以是双链DNA质粒。HDR修复模式在细胞中发生率较低，通常小于10%。为了增加基因敲人的成功率，目前有很多科学家致力于提高HDR效率，将编辑的细胞同步至HDR最活跃的细胞分裂时期，促进修复方式以HDR进行;或者利用化学方法抑制基因进行NHEJ，提高HDR的效率。魏姣旧等通过实验发现在鸡胚中注射腺病毒载体比慢病毒载体具有更高的转染效率，通过CRISPR /Cas9腺病毒载体注射可以在鸡胚ATP5E位点实现EGFP基因敲人。Xie等利用CRISPR/Cas9技术，成功地将猪RSAD2基因（pRSAD2）定点插人到猪rosa26（pR0-SA26）位点，获得了pRSAD2基因敲人PK一15细胞（pRSAD2-KI）和猪胎儿成纤维细胞（PFFs），并从 pRSAD2-KI猪分离的成纤维细胞减少了CSFV的感染。Chu等图应用CRISPR/Cas9技术将8-11kb插人片段敲人C57BL/6小鼠受精卵的Rosa26中，在此基础上建立了Cre/loxP依赖性进行Cas9表达的新小鼠系。

（三）基因抑制/激活（Repression or Activation）

Cas9具有独立切割和结合靶基因的能力，其能够通过点突变的方式使RuvC-和HNH一两个Cas9的结构域失活，形成的dCas9只能在sgRNA的介导下结合靶基因，而不具备剪切DNA的功能。因此，将dCas9结合到基因的转录起始位点，可以阻断转录的启动，从而抑制基因表达;将dCas9结合到基因的启动子区域也可以结合转录抑制/活化物，使下游靶基因转录受到抑制或激活。因此dCas9与Cas9、Cas9nickase的不同之处在于，dCas9造成的激活或者抑制是可逆的，并不會对基因组DNA造成永久性的改变。陈涣兰等9通过基因抑制的方法构建了1种双质粒CRISPR-dCas9系统，该系统可以抑制乳酸乳球菌NZ9000基因转录，通过此方法成功将乳酸乳球菌NZ9000中假定的青霉素酰基转移酶LLNZ-07335鉴定为胆盐水解酶。Brook E. Heaton等叫使用CRISPR激活技术对限制IAV感染的基因进行了全基因组过表达筛选，并通过鉴定筛选出了B4GALNT2基因，该基因虽然通常不在肺中表达但能够完全预防IAV感染，该因子可在将来用于预防严重的人和禽流感疾病。

（四）基因多重编辑（Multiplex Editing）

将多个sgRNA质粒转入到细胞中，可同时对多个基因进行编辑，具有基因组功能筛选作用。多重编辑的应用包括：使用双Cas9 nickases提高基因敲除的准确率、大范围的基因组缺失及同时编辑不同的基因。通常情况下，一个质粒上可以构建2～7个不同的sgRNA进行多重CRISPR基因编辑。

（五）功能基因组筛选

利用CRISPR/Cas9进行基因编辑可以产生大量的基因突变细胞，因此，利用这些突变细胞可以确认表型的变化是否是由基因或者遗传因素导致的。基因组筛选的传统方法是shRNA技术，但是shRNA有其局限性：具有很高的脱靶效应以及无法抑制全部基因而形成假阴性的结果。CRISRP/Cas9系统的基因组筛选功能具有高特异性和不可逆性的优势，在基因组筛选中得到了广泛的应用。目前，CRISPR的基因组筛选功能应用于筛选对表型有调节作用的相关基因，如对化疗药物或者毒素产生抑制的基因、影响肿瘤迁移的基因以及构建病毒筛选文库对潜在基因进行大范围筛选等。

四、CRISPR/Cas9系统存在的问题及展望

CRISPR /Cas9系统与ZFN和TALEN的基于蛋白质的DNA结合的一个关键区别是使用短RNA序列作为特异性决定元件来驱动靶部位DSB的形成。CRISPR/CAS9的使用避免了蛋白质工程开发针对特定DNA靶序列的位点特异性核酸酶的需要，只需要合成一段新的RNA。这大大简化并减少了基因编辑设计和实施所需的时间。虽然CRISPR/Cas9系统近年来发展迅速，已取代之前的基因编辑技术，然而要充分实现CRISPR/Cas9编辑技术的潜力，仍需要应对许多挑战。

目标位点的选择和sgRNA设计是一件非常复杂的工作。Cradick等叫在他们的研究中表明，CRISPR/Cas9的特异性可能低于ZFN或TALEN，这是因为其靶向序列相对较短。因此，sgRNA的合理设计仍然需要大量的工作，目前并没有简单的算法可以帮助科研人员进行设计。同时，为了提高特异性和减少脱靶率，Cas9系统的设计也并不简单，同样需要大量的工作。虽然Cas9本身不会引起脱靶效应，但对Cas9蛋白的改进可以限制这些效应。

关于sgRNA和Cas9蛋白的递送仍然是CRISPR/Cas9系统使用的障碍之一，目前还没有出现通用的递送方法。虽然已经出现许多可用于将CRISPR传递到单元的多种方法，但每种方法都有利有弊，有些方法可能非常特殊或不适合某些类型的传递。

活体生物的安全性也一直是一个令人担忧的问题，能够以高特异性靶向所需细胞的递送工具也将限制非靶标效应并提高安全性。在纳米颗粒载体的情况下，对组件的安全性进行长期研究是至关重要的。目前，关于纳米颗粒传递系统的各种成分最终在体内的哪里，它们在那里停留了多长时间，以及是否有任何与任何成分相关的长期毒性的信息和研究仍是有限的。

CRISPR是现代基因工程的新面孔。2020年，詹妮弗.杜德纳和埃马纽埃尔，卡彭蒂耶被授予诺贝尔化学奖，以表彰她们在“凭借开发基因组编辑方法”方面作出的贡献，诺贝尔委员会在官方颁奖词中表示：“借助这些技术，研究人员可以非常精准地改变动物、植物、和微生物的DNA。CRISPR /Cas9基因剪刀彻底改变了分子生命科学，为植物育种带来了新机遇，有望催生创新性癌症疗法，并可能使治愈遗传性疾病这一人类梦想美梦成真。”我们也希望CRIS-PR/Cas9最终能够实现这个愿望，当然这是一个仍然需要继续研究的重要领域。

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基金项目：国家自然科学基金青年项目“miR-140调控奶牛乳腺脂肪酸代谢的分子机制研究”，项目编号：31802035。

作者简介：路钦越（1997-），男，内蒙古包头人，硕士，研究方向：动物遗传育种与繁殖。

（责任编辑冯会利）