非洲猪瘟检测中的常见问题与分析

2021-11-23孙华伟

猪业科学 2021年10期

孙华伟

（江苏省农业科学院兽医诊断检测重点实验室，江苏南京 210014）

国内猪病实验室从2010年的“懵懂”，2015年的“发展”到2018年的“普及”，给我国猪病诊断及防控工作带来了巨大帮助。尤其是在2018年8月非洲猪瘟（ASF）暴发后，实验室检测在ASF精准剔除（拔牙）、后ASF时代猪瘟、猪蓝耳病等重大疫病的监测评估、诊断防控及净化中必将发挥重大作用。

1 荧光PCR检测的原理

荧光PCR（Q-PCR）是利用荧光信号的变化，实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化[1]。在Q-PCR反应过程中，每经过一个循环，PCR产物量增加，相应的荧光信号强度也跟着增加，此时收集一个荧光强度信号。经过若干个循环后，可以得到一条以循环数（CT）为横坐标和荧光强度变化为纵坐标的“S”形荧光扩增曲线。理论上讲经过n个循环之后，模板量就会达到2的n次方。见图1。

2 常见问题分析

2.1 检测结果出现“翘尾”，怎么处理？

首先按照要求进行复查，复查建议重新采样。如果不方便重新采样建议对原有样本重新进行提取核酸验证，如果复查为阴性则判读阴性；如果复查还是出现“翘尾”，就要对结果仔细审核。一是要排除实验室污染，二是要对病猪信息了解清楚，从临床症状排查，如果仍没法确认，建议必须重新采样复查，如有必要可以采用另一种试剂来验证。如果出现大量的弱阳性扩增翘尾，首要原因是考虑实验室被污染，可以通过做环境样本和阴性对照做验证排除。见图2。

图2 检测结果出现大量的弱阳性扩增翘尾

2.2 非洲猪瘟检测结果和临床诊断不符合，怎么解读？

首先要明白“检验结果与临床不符”并非一个客观的评价，而是一种主观感觉，来源于个人的经验判断。因此并不一定就是结果有误，可能有其他方面的原因。之所以会这样，主要是由于对“不符”的来源认识不够全面，不知道除了熟悉的实验室环节以外，还有哪些方面要去分析？只有对造成不符的原因有一个比较系统的认识，才能做到有的放矢。下面简要介绍可能出现的原因：

2.2.1时间因素

非洲猪瘟病毒的感染有一个发生发展的过程，如果检测时正好处于“窗口期”，就有可能出现漏检的情况。“窗口期”并不是固定的，会随着检测方法敏感性的提高而缩短，但始终会存在。

2.2.2空间因素

取样部位是否合格决定了结果的可靠性。不当的取样可以导致结果假阴性的情况发生。如对活猪尽量采集喉部棉拭子及抗凝血，病死猪采集脾脏和淋巴结。

2.2.3送检因素

检验误差绝大多数来源于分析前阶段，标本质量决定结果是否可靠，样本的现场选择、采集、运输、处理等环节将直接影响检测结果。

2.3 采集环境样本，为什么大部分样本内标不出，偶尔个别样本检测出内标？

因为非洲猪瘟试剂检测的是猪内源性内标，环境样本有时不含有猪源细胞，所以检测不出内标；偶尔检出内标，可能该环境样本上有猪源性细胞黏附，故而检出内标。

3 小结

制定科学合理的日常监测及异常检测方案，避免过度、盲目检测；检测人员要专人专事，执行标准化、流程化、固态化的“simple and good”检测。

3.1 谨防移液器污染

核酸提取、试剂加样等不同操作做到移液器专用，检测过程，所有试剂要放置正前方，不可从敞口的试剂上方经过；提倡空白/阴性对照要从核酸提取开始。对于污染：移液器的污染最为常见，由于操作不慎将样品或提取物吸入枪内或粘上吸头是重要的污染源，因而加样吸取时要十分小心，慢吸，不要多次抽吸，避免交叉污染或产生气溶胶污染。