干扰PIM3的表达对人胰腺癌AsPC-1细胞增殖和凋亡的影响及作用机制研究

陈慧，常瑛，刘振国

西北妇女儿童医院药剂科临床药学室，西安 710000

由于早期症状不明显、发现晚、预后差，胰腺癌已经成为全球病死率最高的恶性肿瘤之一。迄今为止，胰腺癌的临床治疗策略仍仅局限于手术切除、化疗和放疗等传统的治疗方法，治疗效果不理想。因此，寻找更加有效的治疗策略对胰腺癌的治疗至关重要。

近年来，分子生物学技术和基因工程技术的发展有明显进步，研究者开始从分子和基因水平研究胰腺癌发生发展。PIM3作为一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在胰腺癌中异常表达，主要通过磷酸化特异性底物使其失去活性，导致细胞增殖增多、凋亡减少，表现为细胞增殖相关的分子Ki-67的表达升高，促凋亡分子的表达上调，如B细胞淋巴瘤/白血病-2（B cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2），而抑制凋亡相关的分子的表达下调，如Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2-associated X protein，BAX）和caspase 3，最终促进肿瘤的发生发展。但目前关于PIM3在胰腺癌发生发展过程中作用的研究较少。RNA沉默技术，作为一种重要的基因调控机制越来越受到临床的重视，包括小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）。因此，本研究通过设计和合成

PIM3

siRNA，体外转染至人胰腺癌AsPC-1细胞，观察抑制

PIM3

的表达对胰腺癌细胞AsPC-1增殖和凋亡的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞、动物、主要试剂和仪器

人胰腺癌AsPC-1细胞株购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心。裸鼠购自北京华阜康生物有限公司。RPMI 1640培养基购自美国Hyclone公司，胎牛血清购自浙江天杭生物公司，0.25%胰蛋白酶购自上海生工生物有限公司，四甲基偶氮唑蓝（methyl thiazolyl terazolium，MTT）购自美国赛默飞公司，逆转录聚合酶链反应（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）试剂盒购自康为世纪生物科技有限公司，

Ki-67

、

Bcl-2

、

BAX

、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因引物均于华大基因公司合成，Jet PRIME DNA&siRNA体外转染试剂购自Polyplus公司，山羊抗兔β-actin单克隆抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology公司，山羊抗兔PIM3单克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司，膜联蛋白V（Annexin V）-异硫氰酸荧光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）/碘化丙啶（propidium iodide，PI）细胞凋亡检测试剂盒购自上海碧云天生物有限公司，T7体外逆转录试剂盒购自美国TakaRa公司。Galius FACS流式细胞仪购自美国贝克曼公司，Rotor-Gene 6000荧光定量PCR仪购自美国Corbett Research公司，HBS-1101酶联免疫检测仪购自美国Bio-Rad公司。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞转染 人胰腺癌AsPC-1细胞加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培养基，置于37℃、5%CO的培养箱中培养。将培养至对数生长期、生长状况良好的人胰腺癌AsPC-1细胞接种至6孔板中，1×10/孔，待细胞贴壁增殖至50%左右，将加入抗生素的RPMI 1640培养基换成无抗生素的培养基。利用转染试剂Jet PRIME，将

scramble

siRNA（阴性对照，10 μg）和

PIM3

siRNA（干扰

PIM3

的表达，10 μg）分别转染至人胰腺癌AsPC-1细胞，分别作为scramble-siRNA组和PIM3-siRNA组，以1×磷酸盐缓冲液（phosphate buffered solution，PBS）作为溶剂对照，将100 μl的PBS转染至人胰腺癌AsPC-1细胞，作为溶剂对照组。转染6～8 h后将无抗生素的DMEM培养基换成加入抗生素的DMEM培养基，继续培养48 h（用于实时荧光定量RT-PCR检测mRNA的表达）或72 h[用于蛋白质印迹法（Western blot）检测相关蛋白的表达]。1.2.2 实时荧光定量RT-PCR 检测人胰腺癌AsPC-1细胞

PIM3

、

Bcl-2

、

BAX

、

Ki-67

、

caspase3

mRNA的相对表达量 取对数生长期的scramblesiRNA组、PIM3-siRNA组和溶剂对照组人胰腺癌AsPC-1细胞接种于96孔板中，1×10/孔，培养48 h后PBS充分洗涤后，参照Trizol试剂盒说明书提取细胞总RNA。按照说明书配制反应体系：dNTP mix（4 μl）、primer mix（2 μl）、RNA 和 RNase-free wate（r最高13 μl），用70℃孵育10 min，迅速冰浴2 min。继续向反应液中加入以下试剂：5×RT Buffe（r4 μl）、DTT（2 μl）和HiFi Scrip（t1 μl），50℃孵育15 min，85℃孵育5 min。反应结束后，将逆转录得到的 cDNA进一步扩增，加入cDNA（4 μl）、SYBR Green mix（8 μl）、正向引物（2 μl）、反向引物（2 μl）。PCR反应：95 ℃ 5 min，95 ℃ 15 s，60 ℃45 s，50个循环；72 ℃ 10 min，4 ℃保持。以

GAPDH

为内参，2法计算目的基因的相对表达量。各基因引物序列见表1。

表1 引物序列

1.2.3 MTT 法检测人胰腺癌AsPC-1细胞增殖能力 取对数生长期的scramble-siRNA组、PIM3-siRNA组和溶剂对照组人胰腺癌AsPC-1细胞接种于96孔板中，1×10/孔，培养24、48、72 h后，每孔加入MTT试剂10 μl，继续培养2 h，离心，去上清，加入 100 μl 二 甲 基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。采用酶标仪测定OD570和OD630各孔的吸光度以OD630为校正值，计算细胞增殖抑制率=[1-（实验组-空白对照组）（/阴性对照组-空白对照组）]×100%。实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪检测人胰腺癌AsPC-1细胞凋亡能力 取对数生长期的scramble-siRNA组、PIM3-siRNA组和溶剂对照组人胰腺癌AsPC-1细胞培养48 h后，采用Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡能力，参照说明书操作，最后用流式细胞仪检测。将Annexin V与PI联合使用时，早期凋亡细胞被标记为Annexin VPI，而晚期凋亡细胞呈双阳性Annexin VPI，本实验统计前期凋亡和晚期凋亡的综合凋亡比例。

1.2.5 Western blot 法检测人胰腺癌AsPC-1细胞PIM3、Bcl-2、BAX、caspase3蛋白的相对表达量取对数生长期的scramble-siRNA组、PIM3-siRNA组和溶剂对照组人胰腺癌AsPC-1细胞培养72 h后，收集细胞，依据试剂盒说明书提取总蛋白。采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecylsulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分离，然后转至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，在 5%的脱脂牛奶中，室温下摇动封闭1 h。然后加入TBST洗涤3次，每次10 min，加入一抗（山羊抗兔PIM3、β-actin单克隆抗体，稀释比例均为1∶1000），4℃过夜孵育。在室温下洗膜，加入二抗（2%的脱脂牛奶按照1∶2000的比例稀释），室温孵育1 h。洗涤3次，每次10 min。最后进行发光显影，Image J软件分析蛋白表达灰度值，以β-actin为内参，计算PIM3蛋白的相对表达量。

1.2.6 皮下荷瘤小鼠模型的建立及治疗 30只6周龄雄性非肥胖糖尿病/严重联合免疫缺陷（nonobesediabetic/severecombined immunodeficient，NOD/SCID）小鼠，体重（20±1）g，全部饲养于SPF级环境中。常规收集AsPC-1细胞并计数，于每只小鼠腋下左侧荷1×10个细胞，1周后，所有小鼠均有肿瘤出现。随后将30只荷瘤小鼠随机分为control组、阴性对照组和实验组，每组10只，control组小鼠瘤内注射 1×PBS 共 100 μl，阴性对照组和实验组小鼠瘤内分别注射25 μg的

scramble

siRNA和

PIM3

siRNA，100 μl体系。各组小鼠均治疗4次后，用游标卡尺测量肿瘤的长和宽，计算肿瘤体积=长×宽/2，处死小鼠，取出肿瘤，进行称重。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 PIM3mRNA和PIM3蛋白相对表达量的比较

转染后，PIM3-siRNA组细胞

PIM3

mRNA和PIM3蛋白的相对表达量均明显低于溶剂对照组和scramble-siRNA组，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。（表2）

表2 3组人胰腺癌AsPC-1细胞PIM3 mRNA和PIM3蛋白相对表达量的比较（±s）

2.2 干扰PIM3的表达对人胰腺癌AsPC-1细胞增殖能力的影响

转染24、48、72 h后，PIM3-siRNA组细胞的增殖抑制率均明显高于溶剂对照组和scramble-siRNA组，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。干扰

PIM3

的表达对人胰腺癌AsPC-1细胞增殖相关基因

Ki-67

表达影响的结果显示，PIM3-siRNA组细胞

Ki-67

mRNA的相对表达量明显低于溶剂对照组和scramble-siRNA组，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。（表3、表4）

表3 转染不同时间3组人胰腺癌AsPC-1细胞增殖抑制率的比较（%，±s）

表4 3组人胰腺癌AsPC-1细胞增殖相关基因Ki-67 mRNA相对表达量的比较（±s）

2.3 干扰PIM3的表达对人胰腺癌AsPC-1细胞凋亡能力的影响

转染后，PIM3-siRNA组人胰腺癌AsPC-1细胞的凋亡率为（50.77±2.81）%，明显高于溶剂对照组和scramble-siRNA组细胞的（2.33±0.12）%和（2.17±0.09）%，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。干扰

PIM3

的表达对人胰腺癌AsPC-1细胞凋亡相关基因

Bcl-2

、

BAX

、

caspase 3

表达影响的结果显示，PIM3-siRNA组细胞

Bcl-2

mRNA的相对表达量明显低于溶剂对照组和scramble-siRNA组，

BAX

、

caspase 3

mRNA的相对表达量均明显高于溶剂对照组和scramble-siRNA组，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。干扰

PIM3

的表达对人胰腺癌AsPC-1细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、BAX、caspase 3表达影响的结果显示，PIM3-siRNA组细胞Bcl-2蛋白的相对表达量明显低于溶剂对照组和scramble-siRNA组，BAX、caspase 3蛋白的相对表达量均明显高于溶剂对照组和scramble-siRNA组，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。（表5、表6）

表5 3组人胰腺癌AsPC-1细胞凋亡相关基因Bcl-2、BAX、caspase 3 mRNA相对表达量的比较（±s）

表6 3组人胰腺癌AsPC-1细胞凋亡相关蛋白Bcl-2、BAX、caspase 3蛋白相对表达量的比较（±s）

2.4 干扰PIM3的表达对荷瘤小鼠人胰腺癌AsPC-1细胞的影响

实验组小鼠的肿瘤质量和肿瘤体积均明显低于control组和阴性对照组，差异均有统计学意义（

P

＜0.01）。（表7）

表7 3组荷瘤小鼠肿瘤质量和肿瘤体积的比较（±s）

3 讨论

随着分子生物学在肿瘤领域的发展，研究者开始从分子水平探讨胰腺癌治疗的新靶点，原癌基因也由此成为临床关注和研究的重点。目前，肿瘤本身在胰腺癌发病中具有始动作用，可使某些促进肿瘤细胞增殖的分子异常，如PIM3。基因免疫治疗已成为治疗胰腺癌有应用前景的可行策略，引起研究人员的广泛关注。目前，研究者经常采用siRNA技术抑制小分子基因片段，即靶向抑制目的基因的表达，其主要机制是双链RNA被其特异核酸酶酶切降解，产生发挥作用的siRNA，这些siRNA通过与同源的靶序列互补结合而特异性降解目的片段，最终抑制目的基因的表达。该技术需要表达的元件较少且片断较小，利于导入细胞内，操作简单。

有研究发现，应用特异性靶向

PIM3

的siRNA能明显抑制人肝癌细胞系HepG2和Hep3B在体外的增殖，并显著诱导细胞早期凋亡；这种现象也发生在胰腺癌细胞中，若采用短发卡RNA（small hairpin RNA，shRNA）去干扰胰腺癌细胞系PANC.1和PCI35中PIM3的表达，细胞的增殖也会受到明显抑制，细胞凋亡率也会明显上升。但应用siRNA技术对人胰腺癌AsPC-1细胞的生物学影响还未见报道。本研究结果显示，

PIM3

siRNA可以明显抑制人胰腺癌AsPC-1细胞的增殖，

PIM3

siRNA转染至人胰腺癌AsPC-1细胞后，

Ki-67

mRNA的相对表达量明显降低，表明人胰腺癌AsPC-1细胞的增殖可以被

PIM3

siRNA抑制。本研究结果显示，干扰PIM3的表达后，人胰腺癌AsPC-1细胞的凋亡率明显升高，与既往研究结果一致。目前，学者们对细胞凋亡现象进行了广泛、深入的研究，但凋亡的分子和生化机制仍未彻底明了，已经形成的初步认识多源于对

Bcl-2

基因家族的研究。有报道指出，Bcl-2是细胞存活的促进因子，属于膜整合蛋白，可保护肿瘤细胞免受DNA损伤诱导的凋亡作用，Bcl-2还可与促凋亡因子BAX形成二聚体，若BAX的表达水平高于Bcl-2，BAX同二聚体的数量就会增多，从而促进了细胞凋亡。在凋亡通路中，caspase 3发挥着不可替代的作用，正常情况下，caspase 3以caspase 3酶原形式存在，且caspase 3酶原并没有活性。当受到机体内部或外界刺激时，caspase 3酶原被激活，裂解为活性体，激活凋亡的级联反应，提示caspase 3是凋亡通路的关键执行者。本研究对

PIM3

siRNA促进人胰腺癌AsPC-1细胞凋亡的机制进行了探讨，结果表明，干扰

PIM3

的表达后，Bcl-2的表达受到抑制，BAX、caspase 3的表达被上调，最终促进了人胰腺癌AsPC-1细胞的凋亡。

本研究结果显示，干扰PIM3的表达可抑制人胰腺癌AsPC-1细胞在荷瘤小鼠体内的生长，这可能与PIM3 siRNA干扰PIM3的表达，从而直接抑制肿瘤细胞的生长并诱导细胞凋亡有关。本研究为PIM3 siRNA对胰腺癌的抗肿瘤活性研究提供了科学依据，是临床药物研发的基础研究。未来将进一步探讨PIM3 siRNA对其他胰腺癌细胞的作用，为PIM3 siRNA在胰腺癌治疗方面提供更多的实验和理论依据。

综上所述，PIM3 siRNA可通过干扰PIM3的表达，诱导人胰腺癌AsPC-1细胞的凋亡，在体内体外均可抑制胰腺癌AsPC-1细胞的生长。