基于统计学分析比较回流和超声提取方法制备没食子提取物的化学轮廓差异

王 亚，季志红,2，马 璇,2，米尔扎提·麦麦提，李柯翱，张明惠

（1.新疆奇沐医药研究院[有限公司]，新疆 乌鲁木齐 830011；2.新疆医科大学，新疆 乌鲁木齐 830011）

西帕依固龈液是维吾尔族传统药物，是一种以没食子为原料的制剂，具有健齿固龈、清血止痛的作用。西帕依固龈液用于治疗牙周疾病引起的牙齿酸软，咀嚼无力，松动移位，牙龈出血以及口舌生疮，咽喉肿痛，口臭烟臭[1-4]。据报道，西帕依固龈液在口腔护理中具有理想的临床应用价值，没食子提取物是制备西帕依固龈液的重要中间体，影响西帕依固龈液的质量评价[5-6]。没食子为壳斗科植物没食子树（Quercus infectoria Oliv.）幼枝上的干燥虫瘿，由没食子蜂科昆虫没食子蜂（Cynipsgallae-tinctoriae Oliv.）的幼虫寄生而形成[7-9]。没食子又名没石子、墨石子、无食子等，主产于地中海沿岸、伊朗、印度等地，尤以小亚细亚产量最多，新疆地区所使用的没食子多由巴基斯坦进口，我国无分布记载，属外来中药[10-13]。目前，西帕依固龈液的质量控制方法尚不完善，主要成分和活性成分的含量尚未确定，且不同提取工艺直接影响西帕依固龈液的质量，从而无法对西帕依固龈液的质量进行有效监测[14-16]。

本研究的目的是通过高效液相色谱（HPLC）法测定没食子化学成分含量，判断不同提取方法制备的提取物质量是否一致[17-19]；采用化学轮廓计数结合多变量统计分析方法和SPSS统计软件开展没食子不同提取方法的活性成分含量差异研究，从统计分析角度，为不同提取方法制备的没食子提取物的质量评价提供基础数据。

1 仪器与试剂

1.1 试剂 对照品没食子酸（中国食品药品检定研究院，含量：90.8%，批号：110831-201605）；没食子酸甲酯（成都普菲德生物技术有限公司，含量：98%，批号：17092604）；没食子酸乙酯（成都普菲德生物技术有限公司，含量：98%，批号：19042902）；鞣花酸（中国食品药品检定研究院，含量：89.3%，批号：111959-201602）；没食子药材（新奇康药业股份有限公司）；甲醇、乙腈为色谱纯（飞世尔实验器材有限公司）；其他试剂均为分析纯，水为纯化水。

1.2 主要仪器 LC-20AT高效液相色谱仪（日本岛津公司）；KQ-300VDV型数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；XMTD-7000型水浴锅（北京市永光明医疗仪器有限公司）；ME55型十万分之一电子天平（德国梅特勒－托利多仪器有限公司）；ME204T型万分之一电子天平（德国梅特勒－托利多仪器有限公司）；GM-1.0A隔膜型真空泵（天津市津腾实验设备有限公司）；UPT-I-20T型超纯水机（四川优普超纯科技有限公司）；FW135型粉碎机（北京市永光明医疗仪器有限公司）。

2 方 法

2.1 色谱条件 色谱柱：Kromasil C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱条件，见表1；柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；检测波长：273 nm；进样量：10 μL。没食子对照品、不同提取方法制备及处理的样品供试液HPLC图谱[20-21]见图1。

表1 梯度洗脱条件

图1 混合对照品、供试品HPLC 图谱

2.2 混合对照品溶液的制备 精密称取各种对照品适量，加甲醇制成每1 mL含没食子酸62 μg、没食子酸甲酯26 μg、没食子酸乙酯及鞣花酸4 μg的混合对照品溶液。

2.3 供试品溶液的制备

2.3.1 超声法制备的没食子供试品溶液 分别称取6批没食子药材粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50 mL纯化水，超声30 min，放冷，吸取1 mL，置10 mL容量瓶中，用纯化水定容，即得超声法制备的没食子供试品溶液（A1-A6）。

2.3.2 回流法制备的没食子供试品溶液 分别称取6批没食子药材粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，精密加入50 mL纯化水，称定质量，加热回流1 h，放凉，再称定质量，用纯化水补足减失的质量，吸取1 mL，置10 mL容量瓶中，用纯化水定容，即得回流法制备的没食子供试品溶液（B1-B6）。

2.4 QC样品的制备 采用“2.3.2”回流法制备没食子提取物供试品溶液，取续滤液作为QC样品。

2.5 数据采集及数据处理 选择峰A（没食子酸）、峰B（没食子酸甲酯）、峰C（没食子酸乙酯）和峰D（鞣花酸）为参照对齐样品中各色谱峰的保留时间，检测色谱峰，形成样品数据集（包括样品编号、保留时间及峰面积）。将数据导入SIMPCA-P 13.0进行主成分分析（PCA）、聚类分析（HCA）、秩和检验等多变量数据分析，采用SPSS 23.0统计软件对数据进行分析，计量资料若服从正态性可采用“均数±标准差”来描述，组间比较采用方差分析，若不服从正态性可采用中位数和四分位数间距来描述，组间比较采用秩和检验。

2.6 HPLC分析方法的验证 为保障6批没食子数据的可靠性，采用QC样品对仪器和方法的漂移程度进行评价。将QC样品连续进样6次，数据导入SIMPCA-P 13.0软件中，结果见图2。从PCA图中可以看出QC样品聚为一类，显示仪器和分析方法学的重复性和精密度较好，说明数据是可靠的，可以纳入后期的数据整理。

图2 没食子提取物（包括QC 样品）的PCA 图

3 结果与分析

3.1 不同提取方法制备没食子提取物的化学轮廓差异分析 回流法和超声法制备的没食子提取物样品数据扣除QC样品的PCA打分图，可见没食子提取物样品均被清晰地分为两大类，结果表明同一样品用不同提取条件提取存在明显差异；且超声法制备的样品更为集中，即超声法制备样品组内差异小于回流法制备样品，超声法制得的没食子提取物具有更高的均一性。（见图3）

图3 没食子提取物样品的PCA 打分图

为评价样品间质量差异的程度，采用HCA对PCA进行聚类分析柱状绘图，可以看出回流法及超声法提取的样品清晰的聚为2类，超声法及回流法又分为若干类，但超声法分类较回流法少，说明超声法制备的样品更为集中，组内差异更小。结果与PCA打分图一致，表明超声法和回流法制备的样品化学轮廓差异明显，质量差异显著。（见图4）

图4 没食子提取物样品PCA 打分图的HCA 分析柱图

3.2 不同批次及不同提取方法制备的没食子提取物主要有效成分含量变化分析 不同批次的没食子药材经过超声法和回流法提取后发现，回流法提取的有效成分没食子酸和没食子酸甲酯均明显高于超声法（见表2）；回流法制备的没食子提取物中没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯的含量明显高于超声法（P<0.01）；而回流法制备的没食子提取物中鞣花酸的含量则明显低于超声法（P<0.01）（见表3）；含量测定结果表明不同提取方法对没食子提取物中主要有效成分含量的变化有着显著影响，两种提取物的质量具有明显差异。同时可以考虑增加没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯含量作为没食子提取物的评价指标。回流法制备的没食子提取物3种主要有效成分含量较超声法高。但批次间差异过大，导致在PCA图上显示回流法制得样品较为分散。

表2 不同方法不同批次制备的没食子提取物有效成分含量测定结果（，μg/mL，n=3）

表2 不同方法不同批次制备的没食子提取物有效成分含量测定结果（，μg/mL，n=3）

表3 不同提取方法制备没食子提取物的差异比较 [MCP25，P75]

4 讨 论

本实验比较了两种提取方法即回流法和超声法制备的没食子提取物的差异，发现两种提取方法制备的没食子提取物存在质量差异，并筛选出了导致差异的4个特征性化学成分（没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯和鞣花酸）；结合化学轮廓及统计分析角度对结果进行综合分析，从统计分析角度看，两种没食子提取物中主要有效成分没食子酸、没食子酸甲酯、没食子酸乙酯、鞣花酸的含量具有明显差异（P＜0.01），回流法制备的没食子提取物含量高于超声法制得的样品；化学轮廓角度分析则显示超声法制备的样品有更高的均一性，因为回流法提取的主要化学成分含量明显高于超声法，所以导致批次间差异过大，导致在PCA图上显示回流法制备的样品较为分散；从提取工艺与临床应用的相关性角度思考，回流法和超声法制备的没食子提取物，实际上存在质量差异，其化学成分含量有显著变化，这对于以没食子提取物为原料制备生产的临床应用药品品质的影响不可忽视。

研究提示在生产以没食子提取物为原料的药品时，应比较两种提取方法制备的没食子提取物质量间差异及不同处理方法对其成分的影响，并与临床实际应用需求相结合，选择最佳提取制备工艺，以更好地控制药品质量，保证临床疗效[22-23]。今后的研究将深入探讨不同提取工艺如溶剂等对没食子提取物质量的影响，以期为没食子提取物的质量控制提供更为全面的科学依据。