健步汤对去势大鼠骨质疏松症模型骨密度及血清TNF-α、IL-6、IL-1表达的影响*

冯帅华，肖文仲，王国峰，张晓晟，胡桔花，王哲享

（1.湖南省中医药研究院附属医院，湖南 长沙 410006；2.湖南中医药大学，湖南 长沙 410208）

骨质疏松症（osteoporosis,OP）[1]是一类以骨组织微结构破坏为特征，造成骨强度下降，最终导致骨折等其他全身性骨病的疾病。随着老年人口比重的逐年升高，OP已成为各国常见的严重危害人们健康的慢性疾病之一[2]，直接或间接影响生活质量。目前西药在治疗骨质疏松症方面有一定的疗效，但同时伴有一定副作用，如长期激素治疗可出现凝血功能障碍、高血压、水肿、子宫内膜癌、乳腺癌等[3-6]。中药防治OP安全性高、毒副作用小，但目前并没有公认的中药制剂。笔者在临床中运用健步汤治疗老年性骨质疏松症疗效满意，为进一步研究健步汤的作用机制，笔者借助去势大鼠骨质疏松症模型，观察健步汤对去势大鼠骨质疏松症模型骨密度及血清TNF-α、IL-6、IL-1的影响，探讨其部分作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物 44只SPF级6个月龄健康雌性（未交配）SD大鼠，购自湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2016-0002，体质量230～250 g，由湖南省中医药研究院动物实验中心饲养。饲养室温控制于18～28 ℃，12 h间隔照明，定期消毒和通风。本实验经过湖南省中医药研究院附属医院伦理委员会审核，批号：伦审（201701）25号。

1.2 实验药物 健步汤：龟甲胶、鹿角胶、狗骨、制何首乌、川牛膝、杜仲、锁阳、当归、熟地黄、威灵仙各12 g，黄柏、人参、羌活、白芍、白术、附子各9 g，中药均由湖南省中医药研究院附属医院药剂科提供。戊酸雌二醇片（法国DELPHARM Lille S.A.S，药物批准文号：国药准字J20080036）。

1.3 主要仪器与试剂 自动脱水机（湖北泰康医疗设备有限公司），珊顿包埋机（青岛方信医巧器械有限公司），冰冻切片机（英国珊顿公司），显微镜（奥林巴斯（中国）有限公司）。Motic6.0图文分析系统（美国Hologic公司），HOLOGIC4 500A型双能X线骨密度扫描仪（美国Hologic公司），徕卡病理系统（德国Leica公司）。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）试剂盒（批号：20180614）、白细胞介素-6（IL-6）试剂盒（批号：20180614）、白细胞介素-1（IL-1）试剂盒（批号：20180614）均购自南京建成生物工程研究所。

1.4 造模及分组 44只雌性SD大鼠，随机选取12只作为假手术组，假手术组仅行手术摘取卵巢旁约卵巢大小的脂肪组织，不予切除卵巢和结扎输卵管，其余32只大鼠全部行双侧卵巢切除。采用国内外公认的雌性大鼠去卵巢3个月可形成绝经后骨质疏松病理模型。

造模步骤：2%戊巴比妥钠腹腔麻醉，备皮消毒，取腹背部中线第2腰椎水平做长约2 cm双背侧纵行切口，依次分离进入腹腔，寻找卵巢组织，平镊将卵巢牵出，严密结扎输卵管及其周围血管、脂肪组织，完整切除双侧卵巢，冲洗伤口，止血彻底，逐层缝合，关闭腹腔，术后连续3 d注射青霉素20万U，预防感染。连续喂养12周后，假手术组与手术组各随机处死2只行股骨HE染色镜下观察，假手术组切片镜下可见大量清晰成骨细胞，形态完整，骨小梁致密，形态规则，生长旺盛，排列有序；与假手术组比较，手术组大鼠股骨骨小梁数量异常减少、粗细不均、排列无序且断裂明显。（见图1）

图1 两组大鼠股骨组织的形态结构（HE，×100）

大鼠剩余40只股骨全部行骨密度（BMD）检测，结果显示手术组大鼠股骨BMD显著低于假手术组（P<0.05），与HE染色结果一致，证明实验造模成功。（见表1）

表1 假手术组与手术组大鼠股骨BMD 比较（，g/cm2）

表1 假手术组与手术组大鼠股骨BMD 比较（，g/cm2）

造模成功的30只大鼠，按随机数字表分为模型组、中药组和西药组，每组10只。

1.5 实验给药 术后常规喂养12周，于第13周开始给药，中药组及西药组灌胃每日所需给药剂量根据人的临床剂量（X mg/kg）按照人体和大鼠体表面积比换算：

中药组大鼠予健步汤灌胃：按其原处方量计算，成人每日剂量174 g即2.48 g/kg生药，换算成大鼠等效剂量则生药剂量为2.48 g/kg×6.3＝15.66 g/kg；参考前期动物实验有效剂量，本实验取健步汤每日剂量为20 g/kg，1次/d。药物煎制方法：每次将2剂药物，共计348 g，分2次煎煮，每次煎煮时间约为30 min，合计加水2 000 mL，合并2次煎液，并浓缩至348 mL，生药浓度为1 g/mL，每周制备1次，将煎好的中药真空包装冷藏保存备用。西药组大鼠予戊酸雌二醇片灌胃：按照成人每日给药剂量1 mg口服，换算成大鼠等效剂量为0.014 mg/kg×6.3＝0.40 mg/kg，1次/d。假手术组、模型组大鼠予等容量生理盐水灌胃，3mL/次，1次/d。

以上药物连续给药12周后，处死所有大鼠，检测相关指标。

1.6 观察指标

1.6.1 骨密度BMD 灌胃12周后将大鼠进行麻醉，仰卧位置于QDR-4500A双能X线骨密度诊断仪上，测量分析股骨近端干骺端及第4腰椎、第5腰椎BMD。

1.6.2 炎症因子 分别将受试大鼠采用1%戊巴比妥钠麻醉，腹主动脉取血2 mL，离心10 min（3 000 r/min）分离血清5 min，-80 ℃保存备用。采用双抗夹心法测定大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1水平。

1.6.3 骨组织形态学 将大鼠麻醉处死后取股骨，对股骨标本进行常规处理后，用生理盐水冲洗，股骨标本固定于4%的多聚甲醛24 h，然后加入含5.5%EDTA的10%中性福尔马林溶液进行脱钙36 h，放置梯度乙醇逐渐脱水、浸蜡、石蜡包埋，正中矢状面连续切片，切片厚为5 μm，然后使用苏木精-伊红染液进行染色，光镜下随机选取两组骨组织高倍视野拍照，并观察切面单位视野内的骨小梁、软骨细胞等，进行组织形态学观察。

1.7 统计学方法 采用SPSS 21.0进行统计学分析。计量资料以（）表示。符合方差齐性检验时采用单因素方差分析，两两比较采用LSD法检验，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 大鼠一般情况 本次实验过程中4组大鼠状况良好，行造模手术后1周，由于受麻醉剂及相关器官损伤的影响，进食量稍低，体质量增长无明显差异。大鼠造模手术切口均在1周内愈合。实验过程中无大鼠死亡。

2.2 各组大鼠腰椎、股骨BMD比较 给药12周后，模型组大鼠腰椎、股骨BMD水平显著低于假手术组（P<0.05）；中药组及西药组大鼠腰椎、股骨BMD显著高于模型组（P<0.05）；中药组与西药组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。（见表2）

表2 各组大鼠腰椎、股骨BMD 比较（，g/cm2）

表2 各组大鼠腰椎、股骨BMD 比较（，g/cm2）

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

2.3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平比较 模型组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平均明显高于假手术组，差异均有统计学意义（P<0.05）；西药组与中药组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平明显低于模型组，差异均有统计学意义（P<0.05）；中药组大鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1水平与西药组比较，差异无统计学意义（P>0.05）。（见表3）

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1 水平比较（）

表3 各组大鼠血清TNF-α、IL-6 和IL-1 水平比较（）

注：与假手术组比较，aP<0.05；与模型组比较，bP<0.05

2.4 组织形态学观察结果 假手术组大鼠股骨切片镜下可见大量清晰成骨细胞，形态完整，骨小梁致密，形态规则，生长旺盛，排列有序。模型组大鼠股骨切片镜下可见骨小梁排列疏松，数量明显低于假手术组，部分骨小梁出现断裂及钙盐沉积减少等骨质疏松特征性表现。西药组大鼠股骨切片镜下可见骨组织结构较模型组完整，骨小梁相对完整，骨小梁较致密，骨小梁间有少量断裂，形态相对规则。中药组大鼠股骨切片镜下可见骨组织结构完整,骨小梁较模型组增多明显，骨小梁间无明显断裂,成骨细胞排列整齐，形态结构规整，成网状相连续，钙盐沉积较多。（见图2）

图2 各组大鼠股骨骨组织的形态结构（HE，×100）

3 讨 论

骨质疏松症是以骨密度及骨质量下降、微结构改变等为主要表现，导致骨脆性增加、骨折及全身性骨病发生的一类与年龄相关的代谢性疾病。临床上以原发性骨质疏松症较为常见，包括Ⅰ型原发性骨质疏松症（绝经后骨质疏松症）和Ⅱ型原发性骨质疏松症（老年骨质疏松症）。增龄和不健康生活方式是骨质疏松症高发的主要原因[7]。2018年国家卫生健康委员会发布中国骨质疏松症流行病学调查结果显示：OP已成为我国中老年人群的重要健康问题，50岁以上人群患病率为19.2%，且女性发病率明显高于男性。目前，临床治疗骨质疏松症的药物主要包括骨吸收抑制剂（双磷酸盐、降钙素、雌激素等）、骨形成促进剂（甲状旁腺激素类似物）及其他机制类药物（活性维生素D及其类似物、维生素K2类等）。

免疫炎性反应是介导骨质疏松症发生的重要因素之一[8]，TNF-α是一类重要的单核炎症因子，可以通过抑制细胞外基质沉积，降解有机骨质，参与调节骨吸收，通过介导破骨细胞增殖分化影响骨代谢[9]。IL-6是具有多种生物学作用的炎症因子，在骨的多种生物学活动中发挥着重要作用[10-12]。实验研究认为IL-6可参与加强成骨、破骨细胞相互作用从而促进破骨细胞形成。IL-1可增强破骨细胞活性，使骨吸收与骨破坏失衡诱导骨质疏松，与IL-6相互协同[13]。本研究发现，中药组大鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1含量明显低于模型组，说明健步汤可干预炎症因子对破骨细胞的影响，降低破骨细胞活化。

中医学中无“骨质疏松症”的病名，但依据其症状和发病特点，应归属于“骨痿”“骨枯”“骨痹”等范畴。其主要病机为肾精亏耗[14]。《素问·阴阳应象大论篇》云：“年四十而阴气自半也，起居衰矣”，肾脏虚损，冲任失调，天癸渐竭；肾藏精，精生髓，髓养骨骼，故肾精充盈则养骨、健骨，肾精亏损则无以濡养筋骨。

健步汤由《伤科补要》中的“健步虎潜丸”化裁而来，健步汤的组方原则为补肝肾、强筋骨、祛痹痛。方中龟甲胶咸甘微寒，滋阴潜阳；鹿得阳气之精华，鹿角胶可温补肾阳；两药合用取“龟鹿二仙胶”之意，与熟地黄共为君药，发挥滋补肝肾之功；人参补中益气，与鹿角胶同用，可补气助阳，与龟甲胶同用，可益气生津；制何首乌、白芍、当归柔肝养血；杜仲、锁阳强筋健骨；川附子、狗骨（虎骨替代品）散寒止痛，共为臣药；佐药羌活、威灵仙祛风湿，黄柏清热燥湿，白术健脾化湿，四药合用共奏祛湿止痛之效；牛膝引血下行，活血化瘀，调和诸药为使药。诸药合用功擅滋补肝肾、益气活血、祛风除湿，使阴阳调和、筋骨强健。现代药理学研究[15-18]表明，健步汤中多味单药有效成分可通过调控相关基因表达，发挥抑制细胞凋亡、抗炎、抗氧化等作用，可有效延缓骨质疏松的病理进程。前期研究表明[19]，健步虎潜丸可明显改善原发性骨质疏松症患者临床症状、促进骨代谢，且补益肝肾类中药[20]安全性高，疗效显著。罗毅等[21]研究表明经健步虎潜丸血清处理后的大鼠成骨细胞，可从活跃转向成熟状态，且不同浓度及时间对细胞生长有一定影响，表明健步虎潜丸对促进骨形成有着重大意义。同时本研究发现，健步汤可增加大鼠股骨骨小梁数量、厚度，促进钙盐沉积，证实健步汤具有强骨作用。

综上所述，健步汤可有效改善去势大鼠骨质疏松症模型的骨代谢程度，提高骨密度，其作用机制可能与降低血清中TNF-α、IL-6和IL-1表达相关。健步汤能促进成骨细胞增殖分化，降低破骨细胞活性，改善骨小梁结构，从而延缓骨质疏松进程，其疗效与西药雌激素类作用相当，但健步汤中组成方药较多，其有效成分及作用机制仍需进一步探索。