基于文献分析和分子对接技术的生脉散激活Nrf2防治心脏损伤活性成分筛选

高 歌，周 鹏，宋 睿，王舒舒，王 翔，王 靓

（1.安徽中医药大学研究生院，安徽 合肥 230012；2.安徽中医药大学中西医结合学院，安徽 合肥 230012；3.安徽省中医药科学院中西医结合研究所，安徽 合肥 230012）

生脉散出自金·张元素的《医学启源》，由人参、麦冬、五味子组成，具有益气生津、敛阴止汗之功效。近年来生脉散干预多种病因诱发心脏损伤的效应机制研究已成为研究热点，氧化应激是心脏损伤的主要病理机制，而核因子E2相关因子（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）作为一种重要的氧化应激的调节因子，被激活后可向核内转移并启动下游通路信号传导，发挥抗氧化应激作用，被认为是防治心肌损伤的潜在作用靶点[1-2]。研究发现，在小鼠模型的骨髓源性细胞中特异性Nrf2缺乏可加重小鼠动脉粥样硬化[3]；Nrf2的缺失可导致小鼠左室舒张功能不全[4]；在分离的心肌细胞中，Nrf2的过度表达阻止了H2O2诱导线粒体的改变，如线粒体网的破坏、线粒体膜的丢失[5]。目前，关于中药有效成分通过激活Nrf2靶点来治疗心血管疾病的研究增多。研究发现，抗氧化药物可激活体内转录因子Nrf2，诱导、启动下游GST等保护性基因的表达，以维持机体氧化还原平衡，保护组织细胞正常功能[6]。研究发现，右美托咪定可能通过激活Nrf2/HO-1通路，减轻H2O2导致的心肌细胞氧化损伤[7]，但特异性的药物尚不明确，目前可用于激活Nrf2的中药有效成分较多，如黄酮类、三萜皂苷类、醌类、萜类、苯酞类及生物碱类[8]，但对于中药复方研究较少，本研究主要是对生脉散中的潜在活性化合物进行筛选。

分子对接技术作为一种重要的药物虚拟筛选手段，能为从中药复方中寻找较好的先导化合物提供准备[9]。本研究所运用的SwissDock（http://www.swissdock.ch/）在线分子对接工具，用于虚拟筛选小分子化合物与蛋白质之间相互作用强弱，并进行EADock快速计算，进而筛选出活性较高的化合物。因此，本研究采用SwissDock分子对接平台，运用TCMSP数据库和文献相关报道筛选小分子化合物作为配体库，与Nrf2靶点进行对接，根据结合能力打分结果分析生脉散中潜在的激动Nrf2的活性成分，以期为进一步研究生脉散防治心脏损伤的作用机制以及发现天然Nrf2激动剂提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 基于CNKI的近20年生脉散文献可视化分析 以CNKI为检索数据库，检索策略：采用主题词或关键词或篇名为“生脉散”，检索时段为2000年5月1日至2020年5月1日。共检索出1 123篇相关文献，通过排除重复发表的文献、与主题无关的文献、会议摘要、消息、报纸等，最终纳入有效文献491篇。将纳入的文献以Refworks的格式导出，将格式转换后导入CiteSpace V软件中，Top N per slice为50，即选取频率由高到低排列的50项，剪切方式采用Pathfinder，绘制可视化知识图谱[10]。

1.2 靶标蛋白结构的获取和预处理 从蛋白质数据库中（http://www.rcsb.org）下载Nrf2的三维晶体结构（PDB ID：3zgc）[11]。输入Nrf2的pdb结构文件，移去自身配体和水分子，保存为pdb格式文件。

1.3 小分子配体构建 从传统中药数据库TCMSP中寻找生脉散的相关活性化合物，并结合中药在《中华人民共和国药典》中记载的4个特征性化学成分，共计31个化合物。从Pub－Chem化合物数据库（http://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）下载31个小分子化学成分的sdf文件，并通过Chemdraw 3D Ultra软件进行能量最小化计算后，保存为mol2格式文件。

1.4 分子对接 采用SwissDock在线分子对接工具，将生脉散中的31个化学成分与Nrf2靶点进行对接[13-14]，在SwissDock网站（http://www.swissdock.ch/）分别上传靶蛋白和小分子化合物的结构Mol2文件，命名后点击submit。对接结束后，对接结果传至已保存邮箱中，下载压缩文件后，在UCSF chimera软件查看对接结果。对接得分越低，配体与受体结合越稳定，将通过得分值的高低初步评价化合物与靶点的结合活性。

2 结 果

2.1 生脉散防治心脏损伤的文献分析 以关键词为网络节点，并对同义但不同表达的关键词进行合并，如生脉散加味和加味生脉散，心肌炎和病毒性心肌炎，疗效和临床疗效，气阴两虚和气阴两虚证等进行合并，剪裁后形成由91个节点、150条连线组成的关键词共现图谱，热点关键词及其出现频率见表1、图1。对关键词进行分析发现，生脉散具有益气养阴之功效（关键词：气阴两虚、补气剂）；且近年来临床及基础研究（关键词：临床疗效、治疗、大鼠等）聚焦于生脉散干预心肌缺血、心肌缺血再灌注、糖尿病、阿霉素等多种病因诱发心脏损伤的效应研究（关键词：慢性心力衰竭、冠心病、阿霉素、心脏毒性、心肌炎等）。文献分析结果表明，生脉散临床多用于防治多种病因诱发的心脏损伤，其防治心脏损伤效应机制研究受到广泛重视，是近年来研究热点。

图1 生脉散文献中高频关键词可视化图谱

表1 生脉散文献中的高频关键词

2.2 生脉散中小分子化合物信息 选取满足口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、类药性（drug-likeness，DL）≥0.18的27个化学成分作为候选成分[12]，结合《中华人民共和国药典》记载，共获得31个化合物。（见表2）

表2 生脉散中小分子化合物信息

2.3 生脉散中天然Nrf2激动剂活性成分筛选 分子对接结果规定，结合打分值越低说明小分子化合物与靶点之间的结合能力越强，即形成的复合物越稳定。本研究结果显示，生脉散中的31个化合物均能与Nrf2发生不同程度的结合，且结合能力较好的5个化合物均来自于人参，也符合人参在生脉散中作为君药的说法。其中化学成分人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、Alexandrin_qt、花生四烯酸、人参皂苷Rg5_qt与Nrf2的结合打分依次升高，说明结合能力的大小顺序为人参皂苷Re>人参皂苷Rb1>Alexandrin_qt>花生四烯酸>人参皂苷Rg5_qt。虽然人参皂苷Re和人参皂苷Rb1是《中华人民共和国药典》中规定人参的特征性化学成分，但两者的OB均较低，分别为4.27%和6.24%，且两者DL也较低，而分子量均较大，从成药性出发，人参皂苷Re和人参皂苷Rb1很难作为先导化合物，因此，生脉散中可作为天然的Nrf2激动剂优选Alexandrin_qt、花生四烯酸和人参皂苷Rg5_qt，其中激动活性最强的是Alexandrin_qt。（见表3、图2）

图2 生脉散中主要活性成分与Nrf2 分子对接的3D 图

表3 生脉散中活性化学成分与Nrf2对接打分情况

3 讨 论

生脉散中人参为君药，补气，益肺，生津，麦冬为臣药养阴生津，佐以五味子敛阴止汗，益气生津。三药合用，一补一润一敛，益气养阴，生津止渴，敛阴止汗，使气复津生、汗止阴存、气充脉复。随着现代医家的深入研究,发现生脉散对心血管、中枢神经系统、内分泌系统等疾病均有显著的治疗效果。近20年的相关文献分析显示，生脉散对多种原因诱导的心脏损伤有积极的防治效应，其作用机制研究已成为近期研究热点。大量国内外研究表明[15-17]氧化应激及其激活的炎症、自噬、凋亡等病理学改变是心肌缺血、心肌缺血再灌注、糖尿病、阿霉素等多种原因诱发心脏结构和功能损伤的重要病理基础。研究显示[18-19]，Nrf2生理状态下与Keap1耦联并与胞质肌动蛋白结合被锚定在细胞质，处于一种非游离并且不断降解的非活性状态，活性氧（reactive oxygen species，ROS）等病理刺激可诱导Nrf2解离，与抗氧化反应元件（antioxidant response element,ARE）相互作用，能诱导出一系列的保护性蛋白，以缓解细胞所受的损害。Nrf2作为抗氧化应激损伤的关键调控靶点，是保护多种病因诱导心脏损伤的潜在作用靶点[20]。

本研究以生脉散为研究对象，以Nrf2作为潜在调控靶点，对照TCMSP数据库并结合《中华人民共和国药典》从生脉散中筛选符合条件的31个化合物，采用分子对接技术虚拟筛选天然Nrf2激动剂，发现生脉散的主要活性物质来自于人参，包括人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、Alexandrin_qt、花生四烯酸和人参皂苷Rg5_qt等。研究表明，人参皂苷Rb1可促进动脉粥样硬化模型大鼠的Nrf2蛋白核移位，上调HO-1水平，说明人参皂苷Rb1可以激活Nrf2和Nrf2下游基因[21]。人参皂苷Re可促进异丙肾上腺素所致心肌损伤大鼠Nrf2核转位的增加，从而发挥心肌保护作用[22]。Alexandrin_qt与Nrf2的结合能力最强，最有可能作为先导化合物进行进一步改造和开发，同时本研究也从分子对接层面预测了生脉散对Nrf2的调控作用，为后期研究生脉散防治心脏损伤的作用机制，以及发现天然Nrf2激动剂提供了一定的理论依据。