miR-216a-5p在HMGB1介导的表皮葡萄球菌感染致腹膜透析相关腹膜炎中的作用

贾 磊，刘 冰，李卫光

(1. 山东第一医科大学附属省立医院医院感染管理办公室，山东 济南 250021； 2. 山东大学附属省立医院肾内科，山东 济南 250021)

全世界每年有超过10万终末期肾病患者接受腹膜透析治疗，约占透析总人数的10%～15%[1]。我国腹膜透析患者每年呈15%以上的速度增长，新增患者近8 000人/年[2]。腹膜透析并发症中以腹膜透析相关腹膜炎(peritoneal dialysis-associated peritonitis，PDAP)最为常见，而表皮葡萄球菌感染是导致PDAP的主要原因之一。高迁移率蛋白B1(high mobility group protein-B1，HMGB1)是一种高度保守的核蛋白，也是一种晚期重要炎症介质。研究[3]表明，HMGB1抑制剂(甘草素)治疗可显著降低脂多糖大鼠的死亡率，而PDAP患者腹膜透析液中HMGB1表达升高[4]，提示HMGB1可能在PDAP发生及发展中起着一定的作用。MicroRNA是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，参与转录后基因表达调控，已经成为许多疾病的治疗靶点[5]。大量研究[6-7]提示，miR-216a-5p在非小细胞肺癌、哮喘等疾病中发挥关键作用，并与炎症反应关系密切。前期我们通过生信预测发现miR-216a-5p与HMGB1存在相互结合，但目前miR-216a-5p是否通过调控HMGB1参与表皮葡萄球菌感染致PDAP发生发展，尚缺乏研究。本研究建立表皮葡萄球菌感染致PDAP的小鼠模型，并使用甘草素和miR-216a-5p mimics进行干预，探究抑制HMGB1对表皮葡萄球菌感染致PDAP的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料 60只健康雄性C57BL/6J小鼠，购自山东大学实验动物中心；白细胞介素-1α(IL-1α)、白细胞介素-6(IL-6)、肿瘤坏死因素-α(TNF-α)、HMGB1、核转录因子-κB(NF-κB)、核转录因子抑制蛋白(I-κB)抗体，购自中国Proteintech公司；引物、miR-216a-5p mimics、阴性对照miR-216a-5p NC及双荧光素酶HMGB1野生和突变载体，购自中国GenePharma公司；Lipofectamine 3000转染试剂、RT-PCR反转录试剂盒，购自美国invitrogen公司。

1.2 试验方法

1.2.1 建模及分组 成年雄性C57BL/6J小鼠随机分组。对照组：腹腔注射生理盐水200 μL。感染组：腹腔注射表皮葡萄球菌溶液107CFU/mL(用3.86%透析液稀释108/mL的表皮葡萄球菌菌株)[8]，建立表皮葡萄球菌感染致PDAP小鼠模型后注射生理盐水200 μL。感染+HMGB1抑制剂组：腹腔注射表皮葡萄球菌溶液107CFU/mL+腹腔注射甘草素(15 mg/kg，溶于200 μL生理盐水)。感染+miR-216a-5p mimics组：腹腔注射表皮葡萄球菌溶液107CFU/mL+尾部静脉注射miR-216a-5p mimics(3 mg/kg，溶于200 μL生理盐水)，每组15只。

1.2.2 腹腔积液白细胞计数、标本采集 药物干预48 h后麻醉小鼠，腹腔内注射1 mL腹膜透析液，2 h 后切开小鼠腹部，留取腹膜透析液，使用血细胞计数板对腹腔积液白细胞进行计数。取腹膜组织，部分4%多聚甲醛固定，部分液氮保存。

1.2.3 免疫组化染色 冰冻切片65℃烤片，二甲苯脱蜡，乙醇水化；0.01 mol/L的枸橼酸钠进行抗原修复，静置冷却到室温，过氧化氢酶溶液孵育10 min，PBS清洗，山羊血清封闭30 min，滴加一抗4℃孵育过夜。次日切片恢复室温，PBS清洗，加生物素标记的二抗室温孵育1 h,滴加辣根过氧化物酶标记的链霉素卵白素工作液室温孵育30 min，DAB试剂显色，流水冲洗终止显色，脱水风干后，中性树胶封片，显微镜观察拍照。

1.2.4 Real-time PCR检测基因表达 使用Trizol试剂按说明书提取总RNA。依据PrimeScriptTM RT reagent Kit(TaKaRa)试剂盒将RNA样品逆转录成cDNA。利用Light Cycler 480 Ⅱ实时荧光定量PCR系统，以cDNA为模板进行扩增，计算mRNA相对表达量。引物序列见表1。

表1 PCR检测引物序列

1.2.5 Western Blot检测蛋白表达 取冻存组织，按说明书提取各组总蛋白。用BCA 试剂盒测定蛋白浓度，确定蛋白上样量。蛋白样品经过SDS-PAGE电泳浓缩分离，转移至PVDF膜上，5%脱脂奶粉封闭1～2 h，一抗4℃过夜孵育。主要抗体如下：anti-IL-1α(1∶600)、anti-IL-6(1∶1 000)、anti-TNF-α(1∶1 000)、anti-HMGB1(1∶1 500)、anti-NF-κB(1∶2 000)、anti-I-κB(1∶2 000)。TBST洗膜，然后用HRP标记的二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，TBST洗膜。电化学发光(ECL)试剂曝光显影。以β-actin作为内参，使用Image J软件进行半定量分析。

1.2.6 双荧光素酶报告基因检测 构建HMGB1的野生型(WT)和突变型(MUT)双荧光素酶报告载体。使用Lipofectamin 3000将报告基因质粒与miR-216a-5p mimics或miR-216a-5p NC共转染293T细胞，48 h后用双荧光素酶报告基因检测系统测量荧光素酶活性。

2 结果

2.1 表皮葡萄球菌感染致PDAP情况 对照组小鼠精神状态良好，进食饮水、活动正常；感染组、感染+HMGB1抑制剂组、感染+miR-216a-5p mimics组小鼠精神状态欠佳、活动相对减少、进食饮水无明显异常。动物试验过程中，4组小鼠体重、心率差异均无统计学意义(均P>0.05)，4组均无死亡。感染组小鼠腹腔积液白细胞计数高于对照组(P<0.05)，见表2。HE染色显示，对照组小鼠腹膜组织无炎性浸润现象，腹膜组织结构完整；感染组小鼠腹膜出现明显的炎症浸润，炎症细胞增多(见图1a)。免疫组织化学染色显示，感染组IL-1α比对照组增多(均P<0.05)(见图1b)；Western Blot和Real-time PCR结果显示，感染组IL-1α、IL-6、TNF-α的蛋白和mRNA的表达均高于对照组(均P<0.05)(见图1c, 1d)。

表2 各组小鼠腹腔积液白细胞计数情况

2.2 HMGB1在PDAP的作用 免疫组织化学染色、Western Blot和Real-time PCR结果显示，感染组HMGB1表达均高于对照组(均P<0.05)(见图1b～d)。与感染组相比，感染+HMGB1抑制剂组HE染色显示炎性浸润改善，炎症细胞减少；免疫组织化学染色显示IL-1α表达下降(P<0.05)；Real-time PCR和Western Blot结果均提示IL-1α、IL-6、TNF-α mRNA和蛋白表达下降(均P<0.05)(见图1b～d)。Western Blot结果显示，感染组NF-κB蛋白的表达高于对照组、感染+HMGB1抑制剂组(均P<0.05)；感染组I-κB蛋白的表达低于对照组、感染+HMGB1抑制剂组(均P<0.05)(见图1e)。

a：HE染色观察腹膜组织炎性浸润情况(×400)；b：免疫组化染色图(×400)；c：Western Blot 检测蛋白表达情况；d：Real-time PCR 检测mRNA表达情况；e：NF-κB、I-κB蛋白表达情况；*表示感染组与对照组相比，P<0.05；#表示感染+HMGB1抑制剂组与感染组相比，P<0.05。

2.3 miR-216a-5p靶向HMGB1参与PDAP情况 Real-time PCR结果显示，感染组miR-216a-5p较对照组明显减少(P<0.05)(见图2a)。双荧光素酶报告基因检测结果显示，miR-216a-5p mimics可显著抑制HMGB1野生报告基因质粒(HMGB1-WT)组荧光素酶活性，而HMGB1-3’UTR区突变(HMGB1-MUT)后未受影响，提示miR-216a-5p 可直接作用于HMGB1的3’UTR区(见图2b～c)。Real-time PCR结果显示，感染+miR-216a-5p mimics组较对照组明显升高，转染效率差异具有统计学意义(P<0.05)(见图2d)。免疫组织化学染色结果显示，感染+miR-216a-5p mimics组HMGB1表达较感染组减弱(P<0.05)(见图2e)；Real-time PCR和Western Blot结果显示，感染+miR-216a-5p mimics组HMGB1 mRNA和蛋白的表达均较感染组下降(均P<0.05)(见图2f～g)。

a：Real-time PCR检测miR-216a-5p的表达水平；b：HMGB1 3’UTR与miR-216a-5p互补序列；c：双荧光素酶报告基因检测结果；d：miR-216a-5p mimincs的转染效率；e：HMGB1免疫组化染色图(×400)；f：Western Blot 检测HMGB1蛋白表达情况； g：Real-time PCR 检测HMGB1 mRNA表达水平；*表示与对照组相比，P<0.05；#表示与感染组相比，P<0.05。

3 讨论

慢性肾病(chronic kidney disease，CKD)发病率逐年升高，全球患病率约为13.4%[9]，我国患病率约为10.8%[10]，部分患者进展至终末期肾病(end-stage renal disease，ESRD)，需要接受肾替代治疗，其中腹膜透析(peritoneal dialysis，PD)是主要替代治疗方法之一。PDAP是腹膜透析的常见并发症，也是腹膜透析患者死亡的主要原因之一[11-13]。

研究[14-15]发现，PDAP主要以革兰阳性菌感染为主，其中又以表皮葡萄球菌居多。表皮葡萄球菌是一种凝固酶阴性的条件致病菌，广泛存在于人体皮肤和黏膜表面，其导致的感染常与换液操作不规范和污染有关。研究[8]发现，表皮葡萄球菌最易在腹膜透析管内形成细菌生物膜，抗菌药物难以清除，从而造成腹膜炎复发，影响患者治疗与预后。但目前关于表皮葡萄球菌感染致PDAP的发生发展机制仍需进一步探讨。

HMGB1是一种广泛存在于真核细胞的核内因子，同时也是一种重要的炎症介质，在不同急慢性免疫疾病中起重要作用[16]。HMGB1可调节细胞因子的释放，如TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-8，与炎症过程密切相关[17]。研究[4]发现，在大鼠腹腔局部注射HMGB1抑制剂可显著减轻脂多糖引起的腹膜功能及腹膜形态损伤，提示HMGB1在腹膜炎发展中有着一定的作用，然而HMGB1是否与表皮葡萄球菌感染致PDAP有关，目前尚缺乏研究。本组研究发现，表皮葡萄球菌感染小鼠腹膜组织，HMGB1表达明显升高，同时IL-1α、IL-6、TNF-α的表达也明显增加；HMGB1抑制剂干预后，HMGB1、IL-1α、IL-6、TNF-α的表达降低，证实HMGB1在表皮葡萄球菌感染致PDAP中表达升高，同时参与调节IL-1α、IL-6、TNF-α的释放。NF-κB是一种重要的核转录因子，NF-κB介导的信号通路在乙型病毒性肝炎、戊型病毒性肝炎等感染性疾病，小胶质细胞介导的神经炎症等炎症疾病中发挥重要作用，其中包括HMGB1介导的炎症反应[18-20]。I-κB的降解是NF-κB激活的重要标志，随着I-κB的降解，NF-κB的复合物被释放到细胞核中，进而激活NF-κB通路[21]。本研究发现表皮葡萄球菌感染后NF-κB表达升高，I-κB表达降低；甘草素处理后逆转NF-κB、I-κB表达，因此推测HMGB1可以通过影响NF-κB介导的信号通路诱导IL-1α、IL-6、TNF-α的表达，参与表皮葡萄球菌感染致PDAP的发生。

MicroRNA是由大约20个左右核苷酸组成的一种非编码、小RNA，通过靶向3’-UTR区抑制靶基因翻译过程[22]，同时参与调节细胞增殖、细胞凋亡和细胞分化等多种细胞过程[23]。通过TargrtSacn和miRDB数据库分析，发现miR-216a-5p和 HMGB1有相互作用位点，可能存在靶向作用关系，且双荧光素酶报告基因试验结果证实miR-216a-5p 可直接作用于HMGB1的3’UTR区。miR-216a被认为是急性胰腺炎期间判断胰腺损伤的重要血清生物标志物[24]，通过介导不同的靶基因参与梅毒、骨关节炎等疾病的发生[25-27]，通过抑制NF-κB通路的激活，抑制炎症反应[28]。本研究构建miR-216a-5p过表达载体，证实miR-216a-5p可逆转表皮葡萄球菌感染致PDAP HMGB1表达，推测miR-216a-5p是HMGB1的负性调控因子，通过调控HMGB1参与表皮葡萄球菌感染致PDAP。对于miR-216a-5p在PDAP中的作用及具体机制，仍需进一步试验探讨。

本研究各组小鼠均于药物干预48 h后处死，并留取腹膜透析液和腹膜标本用于研究。研究存在周期较短、未设置抗感染治疗对照组，未能系统观察HMGB1对表皮葡萄球菌感染致PDAP小鼠模型转归和预后的影响，未来将进一步研究，为证实miR-216a-5p在HMGB1介导的表皮葡萄球菌感染致PDAP中的作用提供更为充分的试验依据。

综上所述，表皮葡萄球菌感染可导致小鼠腹膜组织HMGB1、NF-κB的活化，并诱导炎症因子IL-1α、IL-6、TNF-α表达水平增高，而HMBG1抑制剂可显著刺激HMGB1、NF-kB的活化以及炎症因子的表达；同时过表达miR-216-5p可明显抑制HMGB1的表达。因此，推测HMGB1在表皮葡萄球菌感染致PDAP发挥重要作用，抑制HMGB1可明显改善炎症反应，miR-216a-5p可通过靶向HMGB1参与表皮葡萄球菌感染致PDAP的发生，将为深入研究表皮葡萄球菌感染致PDAP的发生发展和治疗提供试验依据。