中国2017—2019年耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌耐药基因及流行克隆特征

龙华婧，邱芳华，刘道利，周 意，吴嘉怡，何仰芬

(广州中医药大学附属广州中医医院 1. 检验科； 2. 院感科，广东 广州 510000)

亚胺培南、美罗培南等碳青霉烯类药物对超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)及头孢菌素酶(AmpC)具有高度稳定性，且由于抗菌药物后效应使其具有抗菌活性强、抗菌谱广的特性，被认为是治疗肠道杆菌所致重度感染的最后一道防线[1]。随着碳青霉烯类药物的广泛使用、不合理应用，以及质粒介导的碳青霉烯酶流行，耐药基因通过质粒在细菌间传播及变迁[2-3]，导致耐碳青霉烯类肺炎克雷伯菌(carbape-nem-resistantKlebsiellapneumoniae，CRKP)已呈全球散布[4]。根据全国细菌耐药监测网结果报道，肺炎克雷伯菌对亚胺培南、美罗培南的耐药率分别从2014年的4.8%、4.5%上升到2019年的10.5%、10.9%，五年间上升幅度达2倍以上[5-6]，耐药率上升快速。本研究对2017—2019年CRKP相关检索文献中大量数据进行统计分析，探讨近年来CRKP在我国流行的克隆及分子流行病学特征，为临床上追踪及实时监控CRKP医院感染以及防控提供实际数据支持，现将结果报告如下。

1 资料与方法

1.1 文献检索 通过计算机检索中国知网(CNKI)和万方期刊数据库，检索发表时间为2017年1月1日—2019年12月31日，检索词包括耐碳青霉烯类、肺炎克雷伯菌、耐药和基因。

1.2 文献纳入及排除标准 纳入标准：(1)可获得全文的公开发表期刊论文、学位论文；(2)文献所研究的肺炎克雷伯菌株在中国境内采集，且有具体收集地点；(3)文献数据可提供菌株采集地，用聚合酶链反应(PCR)方法检测耐药基因，通过多位点序列分型(MLST)分析获得ST型别。排除标准：(1)重复报道的文献；(2)综述、病例报告、会议或不能获取全文等文献；(3)文献仅提供菌株药敏分析而不能提供PCR检测的耐药基因或MLST的ST型别。

1.3 数据提取及分析 根据巴斯德研究所网站(https://bigsdb.pasteur.fr/)提供的肺炎克雷伯菌MLST数据库(https://bigsdb.pasteur.fr/cgi-bin/bigsdb/bigsdb.pl?db=pubmlst_klebsiella_seqdef)，将所收集文献菌株的ST型别进行比对，获得各型别的七个管家基因(gapA、infB、mdh、pgi、phoE、rpoB和tonB)，将所有菌株位点信息录入BioNumerics(Version7.6.3)软件创建最小生成树。应用Microsoft Excel 2016软件统计分析并构建相对应的统计图。

2 结果

2.1 纳入文献 初步检索文献202篇，根据纳入及排除标准，下载阅读全文并手工归纳，最终纳入40篇文献[7-46]。共2 094株CRKP，来自全国15个省市，其中2 094株(100%)通过PCR检出耐药基因，859株(41.02%)通过MLST检出ST型别。根据中国七大自然地理分区，本研究暂未纳入来自西北及港澳台地区的CRKP研究数据。

2.2 耐药基因及亚型检出情况 提取2 094株CRKP数据分析发现，1 631株(77.89%)CRKP携带产KPC酶耐药基因，检出亚型主要为KPC-2型(1 014株)；916株(43.74%)CRKP携带超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)耐药基因，其中携带CTX-M型280株，TEM型270株，SHV型366株。215株(10.27%)CRKP携带金属β-内酰胺酶及亚胺培南(IMP)酶耐药基因，其中携带产NDM型130株，检出亚型主要为NDM-1(45株)；携带产IPM型78株，检出亚型主要为IMP-4(22株)；携带产VIM型7株。80株(3.82%)CRKP携带AmpC酶耐药基因，其中携带FOX 28株，DHA 45株，CMY7株；4株(0.19%)CRKP携带OXA酶耐药基因，其中2株为OXA-48亚型；97株(4.63%)CRKP携带喹诺酮类耐药基因。见表1。

表1 2 094株CRKP耐药基因及亚型的检出情况

2.3 耐药基因的地区分布 2 094株CRKP共检出12种耐药基因，其中KPC在各地区占比均最高，东北、华北、华东、华南、华中、西南地区分别为72.73%、92.11%、84.27%、69.39%、62.86%、91.53%。华中地区CRKP携带CTX-M(50.00%)、TEM(35.19%)、SHV(51.46%)、qnrS(23.54%)耐药基因高于其他地区。见表2。

表2 2 094株CRKP耐药基因的地区分布情况[株(%)]

2.4 ST型别检出情况 859株CRKP菌株进行MLST，共检出82个ST型，其中优势型别为ST11(76.72%)，其次为ST15(2.44%)、ST76(1.86%)、ST23(1.28%)。见图1。

图1 859株CRKP的ST型别检出比例

2.5 ST型别地区分布 859株CRKP菌株经MLST分型，共分为82种ST型，优势型别为ST11(3-3-1-1-1-1-4)；65种ST型只分布在1个地区，11种ST型分布于2个地区，3种ST型分布于3个地区，1种ST型分布于4个地区，1种ST型分布于6个地区。见图2。

2.6 耐药基因与ST分型的相关性 共581株CRKP携带产KPC-2酶耐药基因且MLST为ST11,占总ST11型别(共659株)的88.16%。见表3。

表3 耐药基因与ST型别的关系[株(%)]

注：图中每一个圈代表一个ST型,圈的大小代表该ST型所包含的菌株数，位点差异个数不同影响连接线由粗至细、由实至虚，最粗实线位点差异个数为1，以此类推。

3 讨论

本研究纳入CRKP菌株使用PCR方法或MLST的文献，分析碳青霉烯类耐药基因以及菌株变异情况，探讨CRKP菌株的分子分型和种群结构特征。CRKP耐药机制复杂多样，研究[5,47-48]表明，CRKP主要耐药机制为主动外排机制活跃，膜孔蛋白突变或缺失致外膜通透性降低，青霉素结合蛋白作用位点对碳青霉烯类亲和力改变，以及碳青霉烯酶的产生等。CRKP经碳青霉烯类抗生素临床治疗无效后，其耐药基因更易通过整合子、转座子等元件在细菌间进行传播，从而引起耐药菌株暴发流行[49]。CRKP菌株进行基因序列测定及同源性研究，对耐药菌株的克隆散播及医院感染的监测、防控均有非常重要的意义。

本研究创新之处在于统计分析3年CRKP相关文献数据，大数据分析发现我国CRKP主要流行的耐药基因型为KPC-2(62.17%)，且在全国各地区占比均为最多，主要优势序列型别为ST11型(76.72%)，在全国6个地区均有分布，与以往研究[50]结果相符，且有相关研究[51-53]报道此克隆菌株曾引起过医院感染的暴发。产KPC-2的ST11型CRKP菌株[54-56]在我国流行，且近年来逐渐被重视。既往研究[57-58]对单株CRKP菌株进行全基因组测序，阐明产KPC-2的ST11型CRKP的基因序列；另一项研究[59]对一株ST11型CRKP菌株进行Illumina结合MinION的全基因组测序，结果发现由于IS26作用在一个IncR/IncF质粒上共存3个blaKPC-2基因，IS26的多个拷贝可介导耐药基因的增殖，产生复杂的耐药基因遗传背景。已有研究[60]表明，IS26参与了blaKPC的传播和扩增；且耐碳青霉烯的高毒性肺炎克雷伯菌(CR-hvKP)更易产生KPC-2的ST11型克隆菌株，高毒力传播迅速，耐药基因很可能演变成高毒质粒[61]。

虽然对产KPC-2的ST11型CRKP耐药基因的研究不断深入，但耐药基因的散播流行迅速，据本研究显示携带此基因的耐药菌株已遍布全国6个地区。现阶段对CRKP的综合防控应建立多重耐药实时监测体系，临床严格执行抗菌药物应用指征，做到规范合理使用抗菌药物，提高医务人员医院感染防控意识，严格执行手卫生，加强无菌操作培训等措施，避免CRKP在医院内出现暴发流行。