内蒙古荒漠灌木根际解磷菌多样性及其解磷和产铁载体能力

孟建宇， 李 蘅*， 杨鸿儒， 贾丽娟,2

1.内蒙古农业大学生命科学学院， 内蒙古 呼和浩特 010011

2.中国农业科学院草原研究所， 内蒙古 呼和浩特 010010

磷是植物体中蛋白质、核酸和ATP的重要组分，参与多种理化反应的调节过程，是其生长发育过程中必需的营养元素[1]. 土壤中95%以上的磷是不溶性的磷酸盐形式，不具生物有效性[2-3]. 为解决土壤含磷量不足、补充植物生长所需，在实际生产过程需施用大量磷肥，但这会引起食物安全、土壤环境污染等问题[4-5].

解磷细菌(phosphate-solubilizing bacteria，PSB)是土壤中可将不溶性磷素转化为生物能直接利用的磷的一类功能微生物类群，通过分泌多种有机酸、酶类来活化不溶性磷，提高有效的生物可利用磷含量，促进植物的生长和发育[6]. 研究发现，接种PSB后能显著增加土壤及植株的磷、钾、镁等矿质元素含量[7-9]，而且PSB还可改善根际微生物群落结构，促进土壤丛枝菌根对植物根系的侵染，提高植物生长的品质[10]. 毕银丽等[11]将分离得到的PGPR(plant growth promoting rhizobacteria)制成的菌肥施加到荒漠植物的土壤中，不仅提高了有效磷含量，土质由酸性变为中性，并且也增强了酸性磷酸酶活性，最终加快了植物的生长发育. 邢芳芳等[12]分离得到的解磷菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)对白菜有明显的促生作用，经其处理后，白菜叶片数、叶绿素以及产量都有明显提高. 不同类型土壤和植物根际土壤中广泛分布有PSB，其种群、功能和遗传特性等丰富多样[13-14]. 目前对土壤PSB的研究主要集中于玉米、番茄、小麦和油菜等农作物[15]，但对荒漠根际PSB的报道还较少.

内蒙古荒漠区分布广泛，其面积约占全区总面积的51.50%，植被主要有霸王(Zygophyllumxanthonylon)、四合木(Tetraenatnongolica)、沙冬青(Ammopiptanthusmongolicus)、半日花(Helianthemumsoongoricum)和白刺(Nitrariatangutorum)等强旱生、古老孑遗灌木. 它们在保持土壤稳定、改善生态环境方面起着非常重要的作用，而能产铁载体的PSB对灌木生长又有着积极的促进作用. 因此，分析内蒙古荒漠灌木根际PSB类群，认识荒漠灌木植物PSB多样性及其促生特性，丰富功能根际促生细菌资源库以及开发新的改善土壤磷素营养途径，对于改良和保护荒漠地区的生态环境具有积极而重大的意义.

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1样品采集

样品为内蒙古西鄂尔多斯荒漠的霸王、半日花、四合木、白刺和沙冬青5种灌木. 采样方法：先用工具铲除去落叶层，再用铁铲挖去植物基部的上层覆土，剪下一部分主根和须根，用刷子刮下粘在根段上的土壤，装入无菌聚乙烯袋.

1.1.2培养基

牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3.0 g/L，蛋白胨10.0 g/L，氯化钠5.0 g/L.

LB培养基：胰蛋白胨10.0 g/L, 酵母粉5.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，pH为7.2.

无机磷培养基：磷酸钙10.0 g/L，葡萄糖10.0 g/L，硫酸镁0.3 g/L，氯化钾0.3 g/L，硫酸铵0.5 g/L，氯化钠0.3 g/L，硫酸亚铁0.03 g/L，硫酸锰0.03 g/L，pH为7.0～7.5.

PVK培养基：葡萄糖10.0 g/L，磷酸钙5.0 g/L，硫酸铵0.5 g/L，氯化钠0.2 g/L，硫酸镁0.1 g/L，氯化钾0.2 g/L，酵母粉0.5 g/L，硫酸锰0.002 g/L，硫酸亚铁0.002 g/L，0.4%溴酚蓝0.6 g/L，琼脂18.0 g/L，pH为7.0～7.2.

有机磷培养基：葡萄糖10.0 g/L，硫酸铵0.2 g/L，氯化镁5.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L，氯化钾0.1 g/L，植酸钙2.0 g/L.

液体发酵培养基：蛋白胨3.0 g/L，葡萄糖15.0 g/L，可溶性淀粉20.0 g/L，硫酸铵0.5 g/L，氯化钾0.5 g/L，硫酸镁0.03 g/L，硫酸锰0.03 g/L，硫酸亚铁0.04 g/L，磷酸二氢钾0.02 g/L，pH为5.5.

MSA(蔗糖-天冬氨酸)培养基：蔗糖20.0 g/L，天冬酰胺2.0 g/L，磷酸氢二钾1.0 g/L，硫酸镁0.5 g/L，pH为7.0.

1.2 试验方法

1.2.1根际解磷菌的分离

称取植物根际土壤0.5 g放入49.5 mL无菌水的三角瓶中振荡摇匀，按十倍稀释法用无菌水稀释成10-2～10-6梯度的菌悬液，分别涂布于无机磷培养基，每个梯度设3个平行，26 ℃下培养. 5 d后挑取形态各异的单菌落进一步划线纯化. 将纯化的菌株接种到PVK培养基上筛选解无机磷细菌，接种到有机磷培养基上筛选解有机磷细菌.

1.2.2菌株的16S rRNA鉴定及其同源性分析

用CTAB法提取菌株的DNA，16S rRNA基因扩增引物为27F和1492R. PCR扩增体系：5.0 μL 10×PCR Buffer，4.0 μL 2.5 mmol/L的dNTPs，0.5 μL 20 μmol/L的正反引物，0.3 μL 5 U/μL的Easy Taq DNA聚合酶，2.5 μL的DNA模板，37.7 μL ddH2O. 反应条件：94 ℃预变性3 min，94 ℃变性1 min，55 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，30个循环；72 ℃最终延伸5 min. 扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测后送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序的序列上传NCBI，通过Blast-n与EX-TAXON数据库中同源序列进行比对，然后用MEGA 6.0构建系统发育树.

1.2.3解无机磷能力的测定

将获得的纯培养物在PVK培养基上划线培养3 d，挑出划线部分呈蓝色的菌株，采用钼锑抗比色法测定其解无机磷能力. 将初筛菌株接种在LB培养基中，28 ℃下摇床振荡过夜. 离心获得菌体后制成一定浓度的菌悬液，取0.5 mL接种于50 mL无机磷培养基中，置于30 ℃、170 r/min下培养7 d. 然后在 10 000 r/min下离心10 min，并测定上清液的pH. 取上清液1.25 mL于比色管中，再加入2.5 mL钼锑抗比色剂，用去离子水定容，摇匀后静置30 min，测定OD730 nm值，根据标准曲线y=2.733x+0.010 7(R2=0.997 5)计算含磷量.

1.2.4解有机磷能力的测定

将菌株接种到LB培养基中，28 ℃下摇床振荡过夜，离心获得菌体后制成一定浓度的菌悬液，取0.5 mL接种到液体发酵培养基中，置于30 ℃、170 r/min下培养72 h. 发酵液于 10 000 r/min下离心10 min，取上清液1 mL，加入5 mmol/L的植酸钠1 mL，37 ℃下保温30 min，添加3 mL终止液中止反应，然后测定OD415 nm值. 参照磷标准曲线y=24.389x+0.036 6(R2=0.994 7)计算酶活性. 酶活性定义：在37 ℃、pH为5.5的条件下，从浓度为8.4 g/L的植酸钠溶液中每分钟释放出1 μmol无机磷所需要的植酸酶量为1 IU/mL.

1.2.5产铁载体能力分析

用灭菌的牙签挑取单菌落，点接在CAS检测平板上，28 ℃下恒温培养96 h. 记录橙色晕圈的有无，并对晕圈直径(D)及菌落直径(d)进行测定，计算二者比值(D/d)，该值越大，表明产铁载体能力越强，对筛选到的产铁载体能力较强菌株参考Payne[16]的方法进行定量分析. 将可产生晕圈的菌株接种到MSA培养基中，置于30 ℃、15 r/min下培养48 h. 取2 mL 菌液于离心管中，6 000 r/min下离心10 min，取1.5 mL上清液加上1.5 mL CAS检测液，充分混匀静置1 h 后测定OD630 nm值(As)，以双蒸水作为对照. 另取1.5 mL CAS检测液加1.5 mL未接菌的MSA培养基上清液混匀后测定OD630 nm值，作为参比值(Ar). 用As/Ar表示铁载体的相对含量，数值越低，表示铁载体的含量越大.As/Ar值在0～1.0之间以0.2为间隔，每减小0.2，增加一个“+”，As/Ar值低于0.5时产铁载体能力较强(+++)[17].

2 结果与分析

2.1 根际解磷菌的分离及多样性分析

从内蒙古西鄂尔多斯荒漠5种灌木根际土壤中分离到62株细菌，其中半日花15株、白刺3株、霸王9株、四合木26株，沙冬青9株. 根际解磷菌分类类群(见表1)和系统发育分析(见图1)表明，62株解磷细菌分属于α-变形菌纲(α-proteobacteria，占比为22.58%)、β-变形菌纲(β-proteobacteria，占比为17.74%)、γ-变形菌纲(γ-proteobacteria，占比为8.07%)、芽孢杆菌纲(Bacilli，占比为17.74%)、放线菌纲(Actinobacteria，占比为32.26%)和噬纤维菌纲(Cytophagia，占比为1.61%). 其中，放线菌纲为最优势类群，α-变形菌纲是次优势类群. 在属水平上，分属于21个属，分别为短波单胞菌属(Brevundimonas，1株)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas，5株)、苍白杆菌属(Ochrobactrum，3株)、中华根瘤菌属(Sinorhizobium，4株)、根瘤菌属(Rhizobium，1株)、马赛菌属(Massilia，9株)、Prolinoborus(1株)、产碱杆菌属(Alcaligenes，1株)、单胞菌属(Stenotrophomonas，2株)、假单胞菌属(Psedumonas，3株)、芽孢杆菌属(Bacillus，11株)、链霉菌属(Streptomyces，9株)、红球菌属(Rhodococcus，3株)、分枝杆菌属(Mycobacterium，1株)、冢村氏菌属(Tsukamurella，1株)、诺卡氏菌属(Nocardia，1株)、Nocardioide(2株)、短杆菌属(Brevibacterium，1株)、细杆菌属(Microbacterium，1株)、韩国生工属(Kribbella，1株)和Dyadobacter(1株). 其中，芽孢杆菌属为第一优势菌属，占总菌数的17.74%，其次为马赛菌属和链霉菌属，均分别占总菌数的14.52%. 在不同灌木中分离到的PSB多样性差异较明显，如半日花的优势菌属为鞘氨醇单胞菌属和马赛菌属(各占20.00%)，霸王的优势菌属是红球菌属和中华根瘤菌属(各占22.22%)，沙冬青的优势菌属为马赛菌属和芽孢杆菌属(各占22.22%)，四合木的优势菌属为芽孢杆菌属和链霉菌属(各占23.07%). 其中，芽孢杆菌属和马赛菌属分布较广，分别存在于4种灌木的根际土壤中；有些属仅分布于一种灌木的根际土壤中，如短波单胞菌属、韩国生工属和Dyadobacter只在半日花根际土壤中分离到，产碱杆菌属、根瘤菌属、冢村氏菌属和分枝杆菌属只在四合木根际土壤中分离到，细杆菌属和Prolinoborus只在霸王根际土壤中分离到，短杆菌属和诺卡氏菌属只在沙冬青根际土壤中分离到.

表1 分离所得根际解磷菌属水平上的归类

图1 基于16S rRNA基因序列的根际解磷菌分离株的系统发育分析

2.2 解无机磷能力

对能使PVK平板变色的23株细菌的解无机磷能力进行测定，各菌株的解无机磷能力为4.20～33.99 μg/mL(见表2). 其中，有8株菌的解无机磷能力大于20 μg/mL，占菌株总数的30.8%；13株菌的解无机磷能力为10～20 μg/mL，占50%；其余5株的解无机磷能力为4～10 μg/mL，占19.23%；解无机磷能力最强的是霸王SP0205，为33.99 μg/mL.

表2 培养液pH及解无机磷能力

2.3 解有机磷能力

该研究中，既能在无机磷培养基上生长，又能在有机磷培养基上生长的PSB共有32株，分属于链霉菌属(5株)、马西利亚菌属(4株)、芽孢杆菌属(4株)、假单胞菌属(3株)、苍白杆菌属(2株)、中华根瘤菌属(2株)、寡养单胞菌属(2株)、产检杆菌属(1株)、根瘤菌属(1株)、鞘氨醇单胞菌属(1株)、分枝杆菌属(1株)、细杆菌属(1株)、红球菌属(1株)、韩国生工属(1株)、类诺卡氏菌属(1株)、短波单胞菌属(1株)和短杆菌属(1株). 其中，链霉菌占比(15.62%)较高，其次是芽孢杆菌和马西利亚菌，各占12.5%. 这32株解有机磷菌的解有机磷能力如表3所示，有4株菌的解有机磷能力高于100 IU，占菌株总数的10.53%；有7株菌的解有机磷能力为50～100 IU，占18.4%；有17株菌的解有机磷能力为10～50 IU，占44.74%. 其中，解有机磷能力最高的菌株是SP0110-2，高达191.03 IU，具有很好的应用价值.

表3 菌株的解有机磷能力

2.4 产铁载体分析

利用CAS检测平板对筛选出的根际PSB的产铁载体能力进行定性测定，其中有22株PSB的菌落有明显的橙黄色晕圈，SP0412的D/d值最大，为4.83. 定量测定结果(见表4)显示，这些菌株的As/Ar范围为0.47～0.99；As/Ar为0.4～0.6的有7株(SP0412、SP0403、SP0610、SP0115-2、SP0306、SP0203和 SP0201)，产铁载体能力较强；As/Ar为0.6～0.8的有10株，占供试菌总数的45.45%，产铁载体能力中等；As/Ar为0.8～1.0的有5株，占供试菌株总数的22.73%，产铁载体能力比低. 产铁载体菌株占所分离PSB菌株的35.48%，产铁载体能力较强者的比例为31.82%.

表4 产铁载体的根际解磷菌

3 讨论

细菌是根际土壤微生物中数量最多的类群，在维持根际土壤的生态循环方面起着重要作用[18]. 由于植物根系的分泌物和根的脱落物均会影响植物根部的微生物群落，致使不同植物根际的微生物组成也有很大差别，这也势必影响PSB的种群结构[19]. 目前已报道的PSB约有30多个菌属[10]. 该文从内蒙古荒漠灌木植物根际分离到62株PSB，分属6纲21属，说明内蒙古荒漠灌木有着多样性高、种类丰富的根际微生物资源. 根际土壤中一些常见的属种，如芽孢杆菌属、假单胞菌属、根瘤菌属、中华根瘤菌属、鞘氨醇单胞菌属及马西利亚菌属等在所分离的PSB菌株中都有发现，大部分都是已报道过对植物有促进生长作用的细菌类群，包括解磷、产铁载体的属种[10,20]；也有较少报道的属种，如韩国生工属、冢村氏菌属. 有研究[21-23]表明，不同植物根际土壤微生物优势菌门(如变形菌门、放线菌门等)组成具有高度相似性. 笔者也发现，放线菌纲是内蒙古荒漠灌木根际解磷菌的最优势类群，但放线菌的数量则很少，这与程冬梅等[20]对新疆胡杨林根际微生物类群的研究结果一致. 该研究中，芽孢杆菌属是最优势菌属，占总分离菌株总数的17.74%，这与已有报道[24-25]的根际优势菌属相同，该属种的菌株是最早发现的也是解磷效果最好的并且应用最广泛的PSB类群[26]. Kumar等[27]发现，印度Haryana干旱半干旱地区的优势菌类群分别属于厚壁菌门(Firmicutes)和芽孢杆菌属，这与干旱区的内蒙古荒漠灌木根际PSB菌群有一定差异，而且不同灌木间根际PSB组成差异明显，这或许与荒漠灌木种类及所处的自然环境和生态条件有关，但尚需进一步验证.

PSB具有较强的根际效应分布，不同土壤类型下PSB的数量及其解磷能力也不同. 与其他生境植物发现的根际PSB相比，内蒙古荒漠灌木根际PSB的解无机磷能力处于中低等水平，远低于相关报道结果[28-29]. 笔者发现，PSB的解磷量与培养液的pH虽然呈负相关，但相关性并不显著，这与已有报道结果[30]一致，说明非酸类代谢物质可能是所分离菌株解磷的主要机制[31]. 笔者还发现，虽然有一些PSB能在无机磷培养基上产生比较明显的溶磷圈，但定量测定的溶磷量则较低甚至出现负数，这可能是PSB在分解难溶的Ca3(PO4)2过程中，由于溶解产生的可溶性磷被PSB自身细胞吸收或贮藏利用所导致.

对于有机磷降解菌的报道多为芽孢杆菌和假单胞菌[32]. 该研究筛选出的32株解有机磷菌中链霉菌最多(15.62%)，其次为芽孢杆菌和假单胞菌(12.5%)，与上述报道相似. 这32株解有机磷PSB的解有机磷能力高于100 IU的有4株，在50～100 IU之间的有7株，解有机磷能力最强的菌株是SP0110-2，高达191.03 IU，远高于相关报道结果[33-34]，处于较高水平. 该研究中发现具有解有机磷能力的菌株有32株，达到所筛菌株总数的51.62%，共分属于17个菌属，表明荒漠环境下的解有机磷PGPR具有丰富的多样性，这与荒漠灌木的耐贫瘠、耐干旱的能力息息相关.

在低铁环境中，许多PGPR可产生铁载体，可以螯合环境中溶解的铁加以吸收，有效限制了土壤中可溶性铁的供应，致使病原真菌产生铁缺乏，引发麦角甾醇合成途径受阻，抑制细胞膜合成，产生物质渗漏[35]，使其死亡. 所以具有产铁载体能力的细菌不仅具有植物促生能力，还能增强植物抗病原菌能力. 对具有产铁载体能力的PSB的研究表明，来自不同灌木植物根际的产铁载体PSB有着明显的多样性. 在系统发育上，22株产铁载体菌株分属于14个菌属，占全部供试菌总数的35.48%，芽孢杆菌属有6株，占总产铁载体菌株数量的27.27%，为优势菌属，不同于朱彭玲等[36]的研究结果. 目前，有关解有机磷细菌具有产铁载体能力的报道还较少[32]，而笔者筛选到的具产铁载体能力的有机磷降解菌多达18株，占菌株总数的81.82%，且产铁载体能力较强的菌株(占总数的31.82%)全部是解有机磷细菌. 这些研究结果表明，内蒙古荒漠可成为具有多种植物较高促生长能力的解有机磷根际促生菌的重要来源.

4 结论

a) 内蒙古荒漠地区蕴藏着较为丰富的PSB菌种资源. 从西鄂尔多斯荒漠5种灌木根际分离到62株PSB，分属α-变形菌纲、β-变形菌纲、γ-变形菌纲、芽孢杆菌纲、放线菌纲和噬纤维菌纲，其中放线菌纲为最优势菌纲；分属21个菌属，其中芽孢杆菌属为最优势菌属；不同灌木间PSB组成差异比较明显，四合木根际PSB种类最为丰富，而白刺根际PSB种类最少.

b) 分离到的PSB解无机磷能力处于中低等水平，解无机磷能力在4.20～33.99 μg/mL之间；解有机磷的PSB菌株占比较大，且大部分(解有机磷能力高于50 IU的占比为47.83%)解有机磷能力较强，最高可达191.03 IU，处于较高等水平；有22株具有产铁载体能力，且产铁载体能力较强的菌株(占比为31.82%)全部为解有机磷细菌，是解有机磷PGPR的重要来源之一.