四君子汤治疗肝硬化的转录学机制分析

闵筱辉?覃延翔?黎洁瑶?陈其奎?萧焕明?许稷豪

【摘要】目的 探討四君子汤改善肝硬化病理改变的作用，并且研究四君子汤对肝细胞的转录组学改变情况，探索潜在的分子作用机制。方法 采用四氯化碳（CCl4）诱导大鼠产生肝硬化，并用标准剂量的四君子汤灌胃治疗肝硬化大鼠12周，通过肝组织HE染色、Masson染色，从病理学改变评估四君子汤治疗肝硬化效果。随后采取Illumnia高通量测序，同步对转录组学测序结果筛选差异表达基因（DEG），并进行生物聚类分析、KEGG信号通路聚类分析。结果 与正常SD大鼠相比，CCl4诱导的肝硬化SD大鼠肝组织出现广泛的假小叶，转录组学测序共筛选出402个DEG。GO富集分析发现DEG主要富集于细胞周期相关生物学功能。KEGG分析提示DEG明显富集于细胞增殖、分化通路。CCl4诱导肝硬化大鼠在经过四君子汤治疗后，肝脏组织中的假小叶明显减少，共有411个DEG。GO以及KEGG分析提示DEG分别富集于细胞周期生物学功能以及细胞增殖、肿瘤相关信号通路。结论 四君子汤可有效缓解CCl4所诱导的肝硬化，其中细胞增殖相关Wnt通路受到明显调控，可能是四君子汤治疗肝硬化的分子机制。

【关键词】肝硬化;四君子汤;转录组学;细胞增殖

Mechanism of Sijunzi decoction in treatment of liver cirrhosis based on  transcriptomic sequencing

Min Xiaohui， Qin Yanxiang， Li Jieyao， Chen Qikui， Xiao Huanming， Xu Jihao.Department of Gastroenterology， Sun Yat-sen Memorial hospital of Sun Yat-sen University， Guangzhou 510120， China

Corresponding author， Xu Jihao， E-mail： xujh66@mail.sysu.edu.cn

【Abstract】Objective To investigate the effect and molecular mechanism of Sijunzi decoction on the pathological changes of CCl4-induced liver cirrhosis （LC） and evaluate the role of Sijunzi decoction in the transcriptomic changes of liver cells. Methods SD rats were treated with CCl4 to induce LC and given with standard dose of Sijunzi decoction for 12 weeks by gavage. The efficacy of Sijunzi decoction in the treatment of LC was assessed according to pathological changes by HE and Masson staining. The deferentially-expressed genes （DEGs） in CCl4-induced LC rats were identified using Illumina Hiseq sequencing system. The gene ontology （GO） and pathway enrichment analyses were performed in the DAVID and KEGG pathway databases， respectively. Results Compared with the SD wild-type rats， CCl4-induced LC rats presented with multiple liver fibrous septa and cirrhotic nodules. The treatment of Sijunzi decoction significantly reduced liver fiber interval and degeneration degree in CCl4-induced LC rats. A total of 402 DEGs were identified between the wild-type and CCl4-induced LC rats. GO enrichment analysis demonstrated that the DEGs were mainly enriched in cell cycle-associated biological function. The KEGG pathway enrichment analysis revealed that the DEGs were significantly associated with cell proliferation- and cell division-associated signaling pathways. Similarly， Sijunzi decoction treatment led to 411 DEGs in the liver of LC rats. GO and KEGG analyses revealed that those DEGs were significantly enriched in the cell cycle process and cell proliferation- and tumor-associated signaling pathways， respectively. Conclusion Sijunzi decoction effectively attenuates CCl4-induced LC in rat models by regulating the cell proliferation-associated Wnt signaling pathway， which is probably the underlying mechanism.

【Key words】Liver cirrhosis; Sijunzi decoction; Transcripnomic analysis; Cell proliferation

肝硬化是由一种或多种病因长期或反复作用形成的弥漫性肝损害，主要病因为病毒性肝炎、酒精中毒及营养障碍等。病理改变为肝细胞广泛坏死、残存肝细胞代偿性再生形成结节、结缔组织增生与纤维隔形成，进一步破坏肝小叶结构，形成假小叶。肝脏逐步变形、变硬，最终形成肝硬化[1-2]。肝硬化可引起多个并发症，譬如门静脉高压、门静脉血栓、肝性脑病、肝肺综合征及肝肾综合征等[3-5]。肝硬化作为全球第14大死因，每年导致120万人死亡，俨然已成为严重威胁全球的公共健康问题[6]。四君子汤是一种传统的中药制剂，由人参、茯苓、白术、甘草炮制而成[7]。在祖国医学临床实践中，四君子汤主要用于治疗慢性胃炎、溃疡性结肠炎、慢性腹泻、急慢性肝损伤、肠麻痹及习惯性便秘等诸多消化道疾病[8-10]。有文献报道四君子汤可有效改善肝脏切除术后的肝功能和免疫功能，减轻肝纤维化水平[11]。有实验证实四君子汤的应用可以明显减少大鼠肝脏缺血-再灌注损伤时肝细胞凋亡[12]。上述研究提示四君子汤具有潜在抗肝纤维化、修复肝细胞作用，然而目前仍未有研究分析四君子汤对肝硬化的治疗效果及作用机制，因此本研究旨在探索四君子汤对肝硬化的治疗作用及其潜在的分子生物学机制。

材料与方法

一、主要试剂和动物

纯四氯化碳（CCl4）、纯橄榄油购自武汉化学试剂公司，制成10%CCl4橄榄油溶液;制备四君子汤的所有中草药原材料均来自湖北天脊中草药切片有限公司，将所有原料（人参、茯苓、白术、甘草，配制比例9∶9∶9∶6）放入陶瓷锅中，用1500 mL纯水浸泡30 mim，大火煮沸后，文火熬制30 mim，随后用双层纱布过滤汤剂。过滤后的汤剂浓缩成1.0 g/mL，储存在4 ℃环境，使用时在40 ℃后加热[13]。SD雄性大鼠由中山大学实验动物中心购入，共16只，6周龄。大鼠饲养于广东省中医院动物实验中心，饲养环境维持于（23±3）℃，每12 h昼夜明暗交替。动物实验过程均严格遵守中山大学实验动物伦理委员会的伦理准则。

二、肝硬化大鼠模型的建立和四君子汤干预

将16只健康雄性 SD大鼠按编号随机分为H1组（空白对照组，n = 4） 、H2组（干预对照组，n = 4） 、H3组（干预模型组，n = 4）和H4组（空白模型组，n = 4）。采用腹腔注射10% CCl4诱导肝硬化大鼠模型[14]。H3和H4组大鼠腹腔注射10% CCl4橄榄油溶液，给药剂量为1 g/μL，每周3次;H2、H4组在腹腔注射后，给予四君子汤[1.5 g /100 （g·d） ]灌胃干预。H1、H2组大鼠腹腔注射等剂量橄榄油溶液后，给予生理盐水灌胃对照。CCl4造模、四君子汤干预持续12周。

三、肝组织病理染色

在干预终点，对各组大鼠实施颈椎脱臼法处死。本研究采用肝硬化疾病评分模型 （ SLCD，结果记为R值）及拉埃内克纤维化评分系统 （LFSS，LFSS评分中0期为正常肝组织、1 ～ 3期为纤维化期、4A ～ 4C为肝硬化期，L为4B期，可见纤维隔明显增宽、增多，假小叶的数量增加，提示肝硬化造模成功）评估小鼠肝硬化造模效果[15-17]。R值计算公式如下（式中W、T、A、P、I、C分别代表大鼠年龄、血清总胆红素、血清清蛋白、血清前清蛋白、凝血酶原时间国际标准化比值、血清肌酐）：

R = 0.16×（20 - W）/10+0.24×（17.06 - T）/

16.44 + 0.2×（A - 10.33）/11.95 + 0.14×（P - 2.93）/

11.63 + 0.14×（0.92 - I）/0.16 + 0.12×（32.11 - C）/

11 - 61

R = 1表示肝組织正常，0.702≤R < 1表示肝脏炎症反应和局灶性变性、坏死，0.542≤R < 0.702表示肝组织纤维增生，0.352≤R < 0.542表示肝脏假小叶形成，属于肝硬化期，R < 0.352表示肝硬化后期。

沿正中线剪开腹腔，充分暴露腹腔后用真空采血管于下腔静脉采血，标本离心后取上清液上机检测总胆红素、清蛋白、前清蛋白、凝血酶原时间国际标准化比值、血清肌酐等，然后将左叶肝组织剪取下，并浸泡于甲醛固定液，按标准步骤制作成石蜡切片。对肝组织进行HE染色。为了分析肝纤维化区域的网状纤维，按照标准步骤进行Masson染色[18]。用HE以及Masson染色法，比较各组间的差异。在显微镜下（×400）进行肝组织病理观察，肝小叶的广泛形成代表肝硬化造模成功。

四、转录组学测序

转录组学测序的流程主要包括：样品检测、文库构建、文库质量检测、上机测序等部分，用 Illumina 高通量测序平台（HiSeq/MiSeq）进行双末端测序。随后按照以下流程进行测序数据处理：原始测序数据，数据质量评估及数据过滤，参考序列/基因组比对分析，转录本组装。

五、测序数据分析

转录组学测序所得数据进行差异表达基因（DEG）分析，主要包括GO富集分析及KEGG富集分析。分别对转录组学测序数据使用DAVID数据库（https：//david.ncifcrf.gov/）和KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）进行聚类分析，根据默认参数来检索GO和信号通路富集分析[19]。结果只显示生物过程类别和信号通路中富集程度最高的10个聚类。

六、统计学处理

使用SPSS 20.0进行统计分析，正态分布计量资料以  表示，多组间样本比较用单因素方差分析，差异有统计学意义后，用LSD-t法进行两两比较。P < 0.05表示差异有统计学意义。

结 果

一、肝硬化造模成功

HE染色提示，H1、H2组大鼠肝组织结构完整，未见变性或坏死细胞，肝小叶结构清晰，见图1A、B。LSD-t分析提示，H1与H2组R值比较差异无统计学意义，其余各组间R值比较差异均有统计学意义（P均 < 0.05），见表1。H3组大鼠经过CCl4诱导后，肝小叶结构破坏，纤维组织增生，假小叶形成，SLCD评分R = 0.457±0.010。提示肝硬化造模成功，同时肝细胞大量脂肪变性、坏死、纤维间隔形成，肝细胞增生明显，间质内弥漫性炎细胞浸润，见图1C。H4组经过四君子汤治疗12周后，大鼠肝小叶结构因纤维组织分割而紊乱，原肝小叶没有被完全分割，假小叶数量较H3组减少，肝细胞形态与H1组相似（图1D）。

二、四君子汤对肝硬化的治疗效果

Masson 染色显示，H1、H2组大鼠肝小叶结构完整，未见纤维组织增生（图1E、F）。CCl4维持诱导下，H3组大鼠肝小叶结构破坏明显，纤维组织大量增生，并破坏小叶界板，广泛形成假小叶，纤维隔显著增宽;经过四君子汤治疗后，H4组大鼠受CCl4诱导破坏的肝小叶、纤维化范围减少，假小叶数量下降（图1G、H）。

三、四君子汤干预后转录组学分析

根据FDR≤0.05且|log2FC|≥1作为DEG的筛选条件，结果以火山图进行展现。在CCl4诱导的肝硬化模型中，共有402个DEG，其中有284个上调，118个下调（H1 vs. H3，图2A）。通过H4与H3组的对比，分析四君子汤干预肝硬化的作用，共筛选出411个DEG，其中292个上调，119个下调（图2B）。

依据4组的基因表达情况，并按照DEG的筛选条件制作4组DEG表达热点图（图3）。热点图提示共有15个DEG在H3组明显高表达;Rgs16、Ac094053以及Cpne4均在H1组呈现特异性高表达;对比于H1、H3组，Bmp4、Ihh、Rtp3和Lpar6 4个基因均在H2与H4组呈现高表达。

四、DEG聚类分析

对上述DEG进行GO聚类注释、分类以及统计。结果显示，肝硬化病变过程中，DEG在生物过程分类里显著富集于细胞周期及细胞分化相关功能;在分子功能分组上，细胞骨架蛋白结合、蛋白激酶活性及结合、微管结合是显著富集的类型;在细胞组分分组上，微管、细胞骨架、微小染色体维持复合体是显著富集的类型，见图4。

肝硬化大鼠在接受四君子汤干预后，肝组织所产生的DEG，同样也主要富集于细胞周期等相关聚类;而在分子功能聚类中，DEG显著富集在Wnt蛋白结合、核受体活性及蛋白激酶结合等功能。在细胞组分聚类上，微管、细胞骨架及细胞连接是显著富集类型，见图4。

五、KEGG信号通路显著富集分析

同样地，本研究对上述筛选所得出的DEG进行KEGG信号通路富集分析，选取富集程度最高的前30个信号通路。结果显示，CCl4诱导肝硬化 大鼠的肝组织中，DEG主要富集在Wnt、p53、Hippo等细胞增殖、肿瘤相关通路（图5A）。相类似地，四君子汤干预后，肝硬化大鼠肝组织中的DEG显著聚集于Wnt、p53以及Hippo等细胞增殖、肿瘤相关信号通路（图5B）。

讨 论

肝硬化是由于病毒感染、自身免疫异常、药物等因素，造成肝细胞不可逆地破坏，进一步导致肝内假小叶的形成，肝硬化及其并发症对患者的生活质量、生存预后的严重影响[20-22]。基于我国庞大的肝硬化患者群体基数，寻求合理有效的治疗方法改善患者预后是目前极为迫切的需求。四君子汤作为传统的中药复方制剂，在临床实践中被应用于多种消化道疾病治疗，也有报道四君子汤可能对肝硬化有潜在的治疗作用，但是目前尚未有明确的研究验证四君子汤对肝硬化的疗效，以及其中的分子机制[23-25]。本研究者發现，在CCl4的作用下，大鼠肝脏组织广泛出现了典型的肝小叶;而四君子汤能有效减少CCl4诱导的肝假小叶数量，提示四君子汤对肝硬化具有潜在的治疗作用。同时运用转录组学测序分析探索四君子汤改善肝硬化的分子生物学机制。

CCl4诱导的肝硬化大鼠肝细胞转录组学测序得到的DEG，经过GO聚类分析，证实DEG聚集于细胞周期相关生物过程、细胞骨架蛋白结合、蛋白激酶活性及结合、微管结合等分子功能分组上、微管、细胞骨架、微小染色体维持复合体等细胞组分。GO聚类下3个组分的主要分类主要与细胞周期、细胞增殖相关联，细胞周期的有序进行，促进遗传物质复制、细胞更新以及增殖，肝细胞再生即是在细胞增殖调控因子的作用下，肝细胞进行增殖、分化[26]。大鼠肝硬化病理进展中，有关细胞周期相关功能的基因差异化表达，提示肝细胞在上游调控机制作用下，产生增殖、更新功能异常。四君子汤干预作用下，肝细胞的DEG生物学功能聚类主要聚集在细胞周期、分化功能。这一结果提示，四君子汤可调节、修复CCl4诱导肝细胞周期、增殖功能异常，从而产生肝硬化治疗作用。

既往研究提示p53、Hippo、Wnt等细胞增殖、肿瘤相关信号通路参与肝纤维化的分子调控机制[27-29]。类似地，本研究通过KEGG信号通路富集分析发现CCl4诱导肝硬化大鼠的肝组织中，Wnt、p53、Hippo多个基因产生差异化表达。四君子汤的干预，Wnt、p53、Hippo信号通路活性产生明显改变，肝纤维化得到有效的改善。提示四君子汤对这些经典的细胞增殖通路有重要的调控作用。其中，GO分子功能组分分析显示四君子汤干预可影响Wnt蛋白结合，因此，Wnt可能为四君子汤抗肝纤维化、调节肝细胞异常增殖、分化的重要靶点。Wnt通路在细胞作为经典的细胞增殖通路，在维持细胞的正常增殖有着重要作用，通路活性的改变可促进肝细胞异常增殖进一步诱发肿瘤形成[30-32]。

新近研究证实Wnt信号通路的下游靶点CCN4显著上调肝纤维化标志物的表达，从而促进肝硬化的病理进展，靶向调节Wnt通路可能是抗肝纤维化的作用靶点[33-34]。本研究结果显示CCl4诱导的肝硬化组织中Wnt通路多个基因产生差异化表达，而在四君子汤治疗后，Wnt通路受到调控，多个DEG显著聚集于Wnt通路，提示Wnt可能在肝硬化病变中起着重要调控作用，而四君子汤改善肝组织纤维化的过程，显著调节Wnt通路活性，提示Wnt通路可能是四君子汤治疗肝硬化的潜在分子生物学机制。

综上所述，本研究四君子汤对肝硬化大鼠模型干预，证实四君子汤可有效缓解肝硬化进程，可能是作用于Wnt等细胞增殖相关通路，进而调控肝细胞周期、增殖功能，发挥延缓、改善肝纤维化的作用。该发现可能为四君子汤治疗肝硬化发生提供实验依据、理论基础和个体化靶点，为进一步研发传统中医药制剂精确化治疗肝硬化提供重要的实验依据。

参 考 文 献

[1] de Martel C， Georges D， Bray F， Ferlay J， Clifford G M. Global burden of cancer attributable to infections in 2018： a worldwide incidence analysis. Lancet Glob Health， 2020， 8（2）：e180-e190.

[2] 周光德，赵景民.不同病因致肝纤维化/肝硬化的病理特点.临床肝胆病杂志，2016，32（6）：1086-1091.

[3] 刘斌， 方正亚， 孟冬梅， 张国顺.肝硬化并发症治疗及预防研究进展.中华实用诊断与治疗杂志， 2016，30（12）：1152-1155.

[4] 杨智炜， 吴斌. 肝硬化合并门静脉血栓的抗凝治疗进展. 新医学， 2018， 49（1）：6-10.

[5] Kalaitzakis E. Gastrointestinal dysfunction in liver cirrhosis. World J Gastroenterol， 2014， 20（40）： 14686-14695.

[6] Jepsen P， Younossi Z M. The global burden of cirrhosis： a review of disability-adjusted life-years lost and unmet needs. J Hepatol，2021，75（Suppl 1）：S3-S13.

[7] Dong B， Peng C， Ma P， Li X. An integrated strategy of MS-network-based offline 2DLC-QTOF-MS/MS coupled with UHPLC-QTRAP（（R））-MS/MS for the characterization and quantification of the non-polysaccharides in Sijunzi decoction. Anal Bioanal Chem，2021，413（13）：3511-3527.

[8] 郭震浪，蘇振宁，王正飞，罗晓牧. 四君子汤加减治疗慢性萎缩性胃炎的Meta分析. 中国实验方剂学杂志，2015，21（24）：204-208.

[9] 邹孟龙，黄晓燕，陈雅璐，宁芯，阮庆婷，罗贞艺，黎丽群.基于网络药理学探讨四君子汤治疗溃疡性结肠炎的作用机制及实验验证.中国中药杂志，2020，45（22）：5362-5372.

[10] 刘琳，李岩. 四君子汤对胃肠道药理作用的研究进展. 医学综述，2019，25（5）：990-994.

[11] 温晓丽，邱晓静，胡德升，刘莉萍，石豫洁.黄芪四君子汤辅助外科手术治疗原发性肝细胞癌对肝功能及免疫水平的影响.中华中医药学刊，2020，38（12）：42-45.

[12] 华晨，傅永清，傅天啸，周剑，兰菲，任大为.快速康复外科联合四君子汤对急性胆道梗阻大鼠肝脏缺血-再灌注损伤时肝细胞凋亡的影响.中华急诊医学杂志，2014，23（6）：660-662.

[13] Gao B， Wang R， Peng Y， Li X. Effects of a homogeneous polysaccharide from Sijunzi decoction on human intestinal microbes and short chain fatty acids in vitro.J Ethnopharmacol，2018， 224： 465-473.

[14] Yu Q， Cheng P， Wu J， Guo C. PPARgamma/NF-kappaB and TGF-beta1/Smad pathway are involved in the anti-fibrotic effects of levo-tetrahydropalmatine on liver fibrosis. J Cell Mol Med，2021， 25（3）： 1645-1660.

[15] 王正华，郑军，王群兴，罗春华，王雅琴.肝硬化疾病评分模型实验研究.第二军医大学学报，2011，32（5）：485-489.

[16] Kim M Y， Cho M Y， Baik S K， Park H J， Jeon H K， Im C K， Won C S， Kim J W， Kim H S， Kwon S O， Eom M S， Cha S H， Kim Y J， Chang S J， Lee S S. Histological subclassification of cirrhosis using the Laennec fibrosis scoring system correlates with clinical stage and grade of portal hypertension. J Hepatol， 2011， 55（ 5）： 1004-1009.

[17] Sun Y， Zhou J， Wang L， Wu X， Chen Y， Piao H， Lu L， Jiang W， Xu Y， Feng B， Nan Y， Xie W， Chen G， Zheng H， Li H， Ding H， Liu H， Lv F， Shao C， Wang T， Ou X， Wang B， Chen S， Wee A， Theise ND， You H， Jia J. New classification of liver biopsy assessment for fibrosis in chronic hepatitis B patients before and after treatment. J Hepatol， 2017，65（5）：1438-1450.

[18] Xiong F， Zheng Z， Xiao L， Su C， Chen J， Gu X， Tang J， Zhao Y， Luo H， Zha L. Soyasaponin A2 alleviates steatohepatitis possibly through regulating bile acids  and gut microbiota in the methionine and choline deficient （MCD） diet-induced non-alcoholic steatohepatitis （NASH） mice. Mol Nutr Food Res，2021，65（14）：e2100067.

[19] Rao C， Mao C， Xia Y， Zhang M， Hu Z， Yuan S， Yang W， Yan J， Deng L， Cai X， Mao X， Li Q， Liao Y. Transcriptome analysis reveals unfolded protein response was induced during the early stage of burkholderia pseudomallei infection in A549 cells. Front Genet，2020，11：585203.

[20] Acharya P， Chouhan K， Weiskirchen S， Weiskirchen R. Cellular mechanisms of liver fibrosis. Front Pharmacol，2021，12：671640.

[21] Parola M， Pinzani M. Liver fibrosis： pathophysiology， pathogenetic targets and clinical issues. Mol Aspects Med，2019， 65： 37-55.

[22] D'Amico G， Morabito A， D'Amico M， Pasta L， Malizia G， Rebora P， Valsecchi MG. Clinical states of cirrhosis and competing risks. J Hepatol， 2018， 68（3）： 563-576.

[23] Chen Y M， Deng J M， Wen Y， Chen B， Hou J T， Peng B， Zhang S J， Mi H， Jiang Q L， Wu X L， Liu F B， Chen X L. Modified Sijunzi decoction in the treatment of ulcerative colitis in the remission phase： study protocol for a series of N-of-1 double-blind， randomised controlled trials. Trials，2020，21（1）：396.

[24] 紀云飞，王瑞君，李晓波.复方四君子汤的化学成分和药理作用研究进展.中草药，2016，47（5）：837-843.

[25] 张声生，王宪波，江宇泳.肝硬化腹水中医诊疗专家共识意见（2017）.临床肝胆病杂志，2017，32（7）：3065-3068.

[26] Huda N， Liu G， Hong H， Yan S， Khambu B， Yin X M. Hepatic senescence， the good and the bad. World J Gastroenterol，2019，25（34）：5069-5081.

[27] Luo X， Bai Y， He S， Sun S， Jiang X， Yang Z， Lu D， Wei P， Liang Y， Peng C， Wang Y， Sheng R， Han S， Li X， Zhang B. Sirtuin 1 ameliorates defenestration in hepatic sinusoidal endothelial cells during liver fibrosis via inhibiting stress-induced premature senescence. Cell Prolif，2021，54（3）：e12991.

[28] Reichert D， Adolph L， K?hler J P， Buschmann T， Luedde T， H?ussinger D， Kordes C. Improved recovery from liver fibrosis by crenolanib. Cells，2021，10（4）：804.

[29] Yu H X， Yao Y， Bu F T， Chen Y， Wu Y T， Yang Y， Chen X， Zhu Y， Wang Q， Pan X Y， Meng X M， Huang C， Li J. Blockade of YAP alleviates hepatic fibrosis through accelerating apoptosis and reversion of activated hepatic stellate cells.Mol Immunol，2019，107：29-40.

[30] Perugorria M J， Olaizola P， Labiano I， Esparza-Baquer A， Marzioni M， Marin J J G， Bujanda L， Banales J M. Wnt-β-catenin signalling in liver development， health and disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol， 2019， 16（2）： 121-136.

[31] Bisso A， Filipuzzi M， Gamarra Figueroa G P， Brumana G， Biagioni F， Doni M， Ceccotti G， Tanaskovic N， Morelli M J， Pendino V， Chiacchiera F， Pasini D， Olivero D， Campaner S， Sabò A， Amati B. Cooperation between MYC and β-catenin in liver tumorigenesis requires Yap/Taz. Hepatology，2020，72（4）：1430-1443.

[32] Yang T， Xu R， Huo J， Wang B， Du X， Dai B， Zhu M， Zhan Y， Zhang D， Zhang Y. WWOX activation by toosendanin suppresses hepatocellular carcinoma metastasis through JAK2/Stat3 and Wnt/beta-catenin signaling. Cancer Lett，2021，513：50-62.

[33] Pivovarova-Ramich O， Loske J， Hornemann S， Markova M， Seebeck N， Rosenthal A， Klauschen F， Castro J P， Buschow R， Grune T， Lange V， Rudovich N， Ouwens D M. Hepatic Wnt1 inducible signaling pathway protein 1 （WISP-1/CCN4） associates with markers of liver fibrosis in severe obesity. Cells，2021，10（5）：1048.

[34] Nishikawa K， Osawa Y， Kimura K. Wnt/beta-catenin signaling as a potential target for the treatment of liver cirrhosis using antifibrotic drugs. Int J Mol Sci，2018，19（10）：3103.

（收稿日期：2021-06-15）

（本文編辑：杨江瑜）