犬免疫介导性溶血性贫血的诊治

于静茹，牛婉莹，米洁，韩永荣，马新武，卢德章*

（1.西北农林科技大学动物医学院，陕西 杨凌 712100； 2.西北农林科技大学西安动物医院，陕西 西安）

犬免疫介导性溶血性贫血（Immune-mediated hemolytic anemia，IMHA），又称自身免疫性溶血性贫血（Autoimmune hemolytic anemia，AIHA），是由免疫介导性机制导致红细胞加速破坏，进而引起贫血的一种临床综合征。IMHA是犬溶血性贫血常见病因之一，患犬常表现高度溶血和贫血，死亡率可达21%～83%[1]。2019年11月本院接诊一例因注射疫苗导致的IMHA，本文结合该病例及多篇文献对IMHA的发病机理、临床症状、诊断、治疗和预后进行了回顾性分析，旨在为犬IMHA治疗提供临床指导。

1 发病情况

11岁雄性边境牧羊犬，未去势，体重35 kg。该犬2019年10月注射过狂犬疫苗，2019年11月12日开始出现呕吐、小便色黄、饮水减少、食欲逐渐下降等症状。2019年11月17日来到西北农林科技大学西安动物医院就诊。就诊第一天，该犬精神沉郁，趴卧不动，小便呈棕红色（图1），可视黏膜苍白，舌色苍白，体温39.9 ℃，心率128次/min，呼吸88次/min，腹部 触诊未见其他明显异常。

图1 小便颜色

2 初步诊断

初步怀疑为巴贝斯虫感染、免疫介导性溶血性贫血，做CBC、血涂片、犬巴贝斯虫PCR和吉氏巴贝斯虫PCR、尿常规和血清生化检查。2019年11月17日血涂片检查结果：焦虫未见，红细胞大小不一，球形红细胞（+++），自体凝集（+）（图2）。2019年11月17日PCR检查结果：犬巴贝斯虫（-）；吉氏巴贝斯虫（-）。

图2 血液涂片结果

3 诊断结果

根据病史调查、临床症状、尿常规、血常规、血涂片、生化检查及尿液检测，诊断为犬免疫介导性溶血性贫血。

4 治疗

为缓解脱水使用糖生理盐水40 ml/kg，静脉注射；控制炎症反应，应用头孢曲松25 mg/kg，静脉注射和拜有利5 mg/kg，肌肉注射；为控制免疫反应，应用泼尼松2 mg/kg，口服；为预防血管内凝血，应用肝素注射液100 IU/kg，静脉推注。

表1 血常规检查结果

表2 2019年11月17日尿常规检查结果

2019年11月18日，患犬体温恢复正常（38.6 ℃），精神尚可，尿颜色变黄，口色稍红润，少量进食，未见呕吐。状态好转，治疗方案同第一天。

表3 2019年11月17日血清生化检查结果

2019年11月19日，患犬精神状态、饮食良好，尿色接近正常，口色红润。治疗方案同前2 d。

2020年11月20日，患犬病情显著好转，吃喝正常，食欲良好，精神状态尚佳。当天出院，继续使用泼尼松2 mg/kg，口服；阿莫西林克拉维酸钾25 mg/kg，口服。

5 预后

患犬回家后状态良好，精神状况良好，吃喝正常，因此主人于2019年12月10日将泼尼松停药。2020年4月23日，又出现尿血情况，血涂片可见大量球形红细胞，判定IMHA复发，继续使用泼尼松和阿莫西林克拉维酸钾进行治疗。2020年6月20日病情突然严重，主人选择安乐死。

6 讨论

6.1 发病机制

IMHA的发病机理主要是由于红细胞在循环过程中被抗体包被，抗体包被的红细胞跟补体结合在血管内发生溶解，或者被肝脏和脾脏内的巨噬细胞清除。抗体可能是针对红细胞本身（自体免疫性溶血性贫血）的，也可能是针对外源性抗原的[2]。从免疫学角度看，B淋巴细胞与T淋巴细胞在自身免疫性溶血性贫血的发病机制中均有重要作用。B淋巴细胞通过接受或不接受特异性抗原刺激产生抗体，攻击自身红细胞。B1-α细胞和B2细胞数量上升，介导了IMHA患者亢进的自身体液免疫反应。而具有免疫抑制功能的Breg细胞数量减少，使机体免疫调节功能下降。T淋巴细胞中，Th细胞亚群及其分泌细胞因子的失衡参与了IMHA的发病，Th数量上升促进了效应B细胞的分化，Treg细胞数量减少，功能下降导致免疫功能降低。这些都是IMHA发病过程中的重要环节[3]。

原发性IMHA是由于抗体与未改变的红细胞抗原结合，使自身抗原被识别并被免疫系统破坏导致，这些抗原在犬猫仍未研究清楚。包括免疫功能混乱，血细胞膜成分异常，自身免疫性疾病（如红斑狼疮），以及特定品种的遗传因素（研究表明英国牧羊犬、史宾格犬、可卡犬、贵宾犬、柯利犬、雪纳瑞犬等易发[4-6]）。继发性IMHA是由于抗体结合外来抗原并粘附于红细胞膜上，或抗体与抗原发生改变的红细胞结合所致，包括感染、肿瘤、病毒、药物（如头孢菌素、青霉素）、疫苗、有毒物质（如锌、洋葱）、寄生虫（巴贝斯虫）等引起。免疫介导的溶血性贫血是人类临床公认的副肿瘤综合症，慢性淋巴细胞性白血病是人医公认的IMHA病因，尽管目前在动物临床上仍缺乏直接证据，但不能排除肿瘤作为IMHA的潜在诱因[1]。药物和毒素继发的IMHA在临床上也可见到，有实验表明，14只接受递增剂量头孢他酮剂量的犬中有6只获得了抗红细胞抗体[9]，且有相当数量的文献表明药物和毒素可能继发IMHA，因此在诊断时也应考虑到此类病因，并及时消除[1]。接种疫苗被认为是引发犬的IMHA的原因，在一项58只IMHA犬的研究中，15只犬（26 %）在发展为IMHA的1个月内（平均13 d，范围1~27 d）进行了疫苗接种[7]，免疫过和未免疫过的患犬死亡率无明显差异，但目前的疫苗接种策略是安全的，建议接种疫苗前应进行个体评估，以评估疫苗对自身的风险和益处[8]。该病例发病前一个月注射过疫苗，因此高度怀疑是由于疫苗接种导致的IMHA。

6.2 临床症状

患IMHA的动物一般表现为精神沉郁、食欲减退甚至废绝、四肢无力、趴卧不动、可视黏膜苍白、高烧、呼吸促迫、心率加快、尿液呈棕红色，严重者出现黄疸。严重贫血患犬甚至因供血不足和不良免疫反应出现四肢、尾、耳端等远心端发冷坏死，颜色发绀甚至变黑[8]。

6.3 诊断

IMHA诊断取决于全血细胞计数（CBC）、血液涂片、血清生化检测等，进一步诊断检测需要判断是否存在潜在的继发病因。

6.3.1 全血细胞计数（CBC） 根据病史调查、临床症状、血液检查等初步怀疑IMHA的病例，首先要判断该犬是否存在贫血，贫血时红细胞系检查可见各项指标均低于正常范围，根据红细胞压积（PCV）可判断贫血的严重程度，通常为中度至重度贫血。IMHA多为再生性贫血，但缺乏再生能力（即网织红细胞数量不增多）并不能排除IMHA的可能，因为大约有30 % 的IMHA犬为非再生性贫血[1]，这是由于当IMHA急性发作和出现时，骨髓还未来得及作出反应及出现对抗骨髓前体的抗体；网织红细胞在进入外周循环之前已经被破坏；炎症抑制骨髓，红细胞再生不良。多数IMHA患犬会存在炎性白细胞象。血小板的降低多是由于免疫介导性血小板减少症、血栓和DIC等一种或多种原因引起[10-11]。通常可以通过网织红细胞数超过100 000/µl或网织红细胞指数（reticulocyte index，RI）的百分比超过3 %，且贫血表现为轻微到中度，初步判定为再生性贫血。但对于非再生性IMHA，则需要进一步通过骨髓穿刺对细胞学或组织学分析确诊[12]。

本病例中，红细胞平均血红蛋白量MCH、红细胞平均血红蛋白浓度MCHC、网织红细胞血红蛋白RETIC-HGB都可以反应血红蛋白浓度。由于发生溶血性贫血，大量红细胞破裂溶血，血液中血红蛋白随尿液排出，同时骨髓未失去再生能力，代偿性产生大量新生的红细胞，发育成网织红细胞进入血液。由于短时间大量产生新生红细胞，机体可利用铁大量流失，导致体内铁储存量降低，因此网织红细胞血红蛋白量降低，平均血红蛋白量、浓度也随之降低。而由于再生性贫血使骨髓红细胞生成增加，最终使红细胞数量等指标达到正常值，因此尽管RBC、HCT、HGB正常，但仍属于贫血。红细胞在溶解过程中产生大量分解物，激发了白细胞生成增加；另外，由于贫血导致组织器官缺氧性坏死，导致出现局部炎症，因此CBC显示WBC高于正常值，所以应使用抗生素进行治疗。由于抗体包围的红细胞更易粘合在一起形成凝块，甚至最终形成血栓，在此过程中有血小板参与，导致血液中PLT值应减少，但在本病例中，由于溶血性贫血继发了骨髓的病理性增生，导致PLT增加。因此，PLT的数值可以作为IMHA治疗效果评价的指标之一，若PLT数值增加，说明体内溶血性贫血仍在继续，需要加大药物剂量或更换免疫抑制药物。

6.3.2 血液涂片检查 血涂片可见红细胞凝集像、网织红细胞增多、大量球形红细胞、红细胞大小不等等变化。免疫介导性溶血性贫血的红细胞形态学特点是出现大量的球形红细胞。球形红细胞是巨噬细胞移除部分抗体覆盖的红细胞膜而形成的，具有体积较小、圆形、深染，无中央灰白区域的特点，球形红细胞较正常的红细胞更脆且不易变形，通过脾脏时被清除。球形红细胞在犬易被识别，但在猫识别困难，因为其正常红细胞缺乏显著的中心苍白区。在犬出现足够数量时可诊断为IMHA。影细胞为红细胞胞质内几乎不含血红蛋白为特征，通常表面发生了血管内溶血，溶血可能由免疫性或非免疫介导性机制所诱发，因此，影细胞在IMHA时可能会出现，但对于IMHA不具有标志性的诊断意义。血涂片上可见红细胞发生自体凝集。红细胞凝集还可通过库姆斯实验（Coomb’s test）（直接抗球蛋白实验）来确诊，当自体凝集或球形红细胞增多症不出现时，使用多价抗血清的直接库姆斯试验最常用于诊断IMHA，不过，该检测对于IMHA确诊既不敏感也不特异。

在免疫介导性球形红细胞形成过程中，针对红细胞膜抗原、红细胞膜与外源性抗原复合体或红细胞膜新的抗原位点形成抗体，这些抗体与红细胞相结合，为巨噬细胞识别并被其吞噬破坏。巨噬细胞，特别是脾脏巨噬细胞，部分吞噬红细胞引起细胞膜相对细胞容积减少。余下的细胞膜重塑，产生较小的、浓缩的球形红细胞。因机体产生抗红细胞抗体，红细胞表面本身的抗原或红细胞与外来抗体结合，在有或无补体的情况下与抗体发生反应，引起红细胞凝集或溶血。在本病例中血涂片中未发现巴贝斯虫，PCR检查也未发现巴贝斯虫感染。因此可以排除寄生虫继发的IMHA。

6.3.3 血清生化检测 红细胞数量的降低可能导致全身不同程度的供血和供氧的不足，肝细胞可能会出现一定程度的损伤，导致肝脏酶指标的升高。由于红细胞的溶解，常见高胆红素血症，但并非所有的IMHA均会出现，这取决于溶血的速率和肝脏的功能。IMHA犬的死亡与并发的肝脏衰竭和肾脏衰竭有关[13-14]，因此，肝肾功能指标的检测对IMHA病例的预后有一定的提示意义。

本病例中生化检查见天门冬酸转氨酶和总胆红素升高，总胆红素升高是由于溶血，天冬氨酸转氨酶的升高则提示肝组织损伤，由于胆红素产生速度超过肝脏代谢能力，使肝脏超负荷，致使肝组织损伤。另外，由于贫血导致全身不同程度的供血和供氧不足，当肝脏无法获得足够的供血和供养的情况下，干细胞就会出现一定程度的损伤，导致肝酶升高。

6.3.4 尿检 患IMHA的犬通常可见血红蛋白尿，如果没有引起肌红蛋白尿的原因，尿液呈棕红色，离心后上清红色，或者在显微镜沉渣检查没有完整红细胞的情况下，则认为存在血红蛋白尿[1]。

本病例中出现血红蛋白尿，尿液中尿胆原、胆红素均高，是由于溶血时释放出大量血红蛋白，血红蛋白被网状内皮细胞转变为胆红素，游离于血浆中。游离胆红素进入肝脏后，经肝细胞的摄取、结合、排泄，随胆汁经总胆管排入肠道，最后被还原为尿胆原排出。当胆红素产生速度超过肝脏转化及机体排泄能力，胆红素被血液带到各个器官，出现黄疸。当损伤红细胞释放出的血红蛋白量超出了结合珠蛋白的结合能力，游离血红蛋白可经肾小球滤出，溢出过多不被肾小管完全吸收，而产生蛋白尿，称为溶血性蛋白尿。综合尿蛋白高、微量溶血、尿中白细胞高来看，很可能由于自身免疫性溶血产生的免疫复合物沉积在肾脏继发了急性肾炎，导致肾小管功能减退，肾小球滤过作用下降，尿中出现潜血、白细胞、蛋白等，提示应及时应用抗生素进行治疗。由于犬近一周食欲不振，长期处于饥饿状态，因此尿酮体高，但因尿中有微量葡萄糖，也应考虑糖尿病的可能性。

6.3.5 其他进一步检测 消除引起IMHA的病因可以减轻或阻止免疫介导的红细胞破坏，并且可以避免长期免疫抑制治疗的不良后果。感染、肿瘤、药物、疫苗和炎症可能是继发IMHA的根本原因，需要通过完整的病史调查，尿液分析培养、影像学检查、传染性疾病检测、骨髓细胞学或组织病理学、神经学检查等一系列完整的体格检查来逐一排除。据文献报道，约有一半的IMHA患犬死亡是与血栓有关[15]，临床关于犬D-二聚体检查、凝血功能检查也是至关重要的。

6.4 治疗

6.4.1 输血治疗 是否输血应取决于具体患者的具体情况，包括临床症状的严重程度、静息时血液中的乳酸浓度、品种正常的PCV/血细胞比容（Hct）值、贫血的发展速度以及患者监测和支持治疗的有效性。应给急需红细胞（即不输血会导致动物死亡）的患者立即输血，对于不能住院进行强化监护的进行性贫血患者，应尽早地考虑输血。当患病动物表现出运氧量减少的临床特征时，建议使用新鲜的浓缩红细胞（pRBC）。如果没有pRBC，则可以输全血，不建议对IMHA的犬使用新鲜的冷冻血浆[16]。需考虑到自体凝集对交叉配血和血型检测结果的影响。本病例因为发现较及时，并不需要进行输血治疗。

6.4.2 免疫抑制治疗 免疫抑制药物是预防IMHA患犬溶血的关键所在。在确诊IMHA后，使用某些药物，特别是糖皮质激素可能会干扰潜在疾病的检测，如淋巴瘤，因此，应尽早对疑似癌症或传染病的病例进行诊断评估，诊断明确后应尽早开始使用高剂量糖皮质激素，能口服给药的患犬，可选用泼尼松。使用泼尼松龙或泼尼松以初始剂量为2~3 mg/kg·d口服给药，对于大于25 kg的犬，以50~60 mg/m2的初始剂量口服给药。该药物可以单日剂量给药或分成两日剂量给药。如果患者最初不耐受口服药物治疗，则可以先静脉内注射地塞米松（0.2~0.4 mg/kg·d）。在犬对治疗有反应，即PCV/HCT稳定或增加的情况下，如果泼尼松或泼尼松龙的起始剂量 >2 mg/kg·d，建议在治疗的前1~2周内将其降低至≤2 mg/kg·d。长期使用此类药物有多种严重的副作用，会出现烦躁不安、多尿、过度气喘、和嗜睡等症状，伴有肌肉无力或萎缩[16]。当开始治疗后2周内PCV/HCT保持稳定且> 30 %时，且大多数疾病活动性指标（包括血球增多，血清胆红素浓度和网织红细胞数）均得到改善，可以减少强的松或泼尼松龙25 % 给药剂量。如果为了限制糖皮质激素相关不良反应而引入了第二种药物，则不应改变该药物的剂量，但是如果犬对治疗表现出足够的反应，则泼尼松或泼尼松龙的剂量可进一步减少（25 % ~ 50 %）。若继续治疗效果良好、情况稳定，可以每3周将泼尼松或泼尼松龙的剂量减少25 %。在大多数情况下，泼尼松或泼尼松龙的典型治疗时间预计为3~6个月，整体免疫抑制治疗的预期持续时间为4~8个月。停用泼尼松或泼尼松龙后，在接受另一种免疫抑制药物的犬中应选择以下停药方式之一：继续使用免疫抑制剂4~8周并突然停药；以和泼尼松龙或强的松同样的减药方式逐渐减少免疫抑制剂的给药量[16]。

一些IMHA犬对单用糖皮质激素无反应，或泼尼松不能降至足以解决其副作用的剂量。这些病例，可以从治疗开始就引入第二种免疫抑制药物，以减少所需的糖皮质激素剂量。特别是以下情况：犬表现出严重或立即威胁生命的疾病的临床特征；犬依赖输血治疗，输血7 d后仍需输血；严重不良反应，特别是大型犬。重病例开始就引入两种免疫抑制剂，因为多数犬只对其中一种反应差，应避免同时使用三种及以上免疫抑制剂。推荐使用的免疫抑制剂包括：硫唑嘌呤（2 mg/kg或50 mg/m2PO每24 h）；环孢菌素（5 mg/kg PO每12 h）；霉酚酸酯（8~12 mg/kg PO每12 h）。有证据表明联合环磷酰胺治疗并没有单独使用糖皮质激素治疗更有效，且可能对长期预后不利，因此不推荐环磷酰胺[16]。

人静脉免疫球蛋白对于其它治疗无效的IMHA患犬或许有很好的作用。目标是用外来免疫球蛋白抑制MPS内的Fc受体，进而减少对抗体包被红细胞的吞噬。早期给予人静脉免疫球蛋白在治疗急性严重性IMHA可能最有用，以控制其它免疫抑制药物等待发挥作用期间的急性溶血。此法缺点在于价格昂贵以及购买困难。

本病例使用泼尼松2 mg/kg进行治疗，由于动物主人医从性较差，2019年12月就自行停药，后期复发后再使用泼尼松治疗效果不佳。因此，对于IHMA的治疗，大部分病例需要长期使用泼尼松。再次复发后，可以使用环孢菌素等联合治疗。

6.4.3 抗血栓治疗 由于有很多急性或亚急性IMHA犬伴发黄疸和自体凝集，所有IMHA犬都应预防血栓形成，严重血小板减少症（血小板计数 <30 000 µl）的患者除外。建议在诊断时开始进行血栓预防，一直持续到患者缓解并且不再接受泼尼松或泼尼松龙为止。优先使用普通肝素（UFH），进行个体剂量调整。普通肝素（IV）：100 U/kg推注，然后900 U/kg/24 h或普通肝素（SC）：150~300 U/kg·6h[16]。本病例中患犬PLT高于正常值，有较大可能并发DIC和血栓等疾病，为预防此类并发症，在治疗初期就采用静脉输注普通肝素。

6.4.4 脾脏摘除 以上疗法基本无效的严重IMHA病例，需要考虑脾切除术。脾切除后可断绝B细胞和巨噬细胞的来源，并消除红细胞破坏的场所，以减少抗体的形成和红细胞的破坏[16]。有效率在60 % ~ 70 %，对继发性IMHA效果较差。本病例再次复发后，曾建议进行批脏摘除，但是主人拒绝。

6.4.5 支持疗法 补液、吸氧、抗菌消炎、调节血气电解质失衡，对症治疗等。

静脉大量补液可以缓解和预防脱水、平衡电解质，并防止溶血产物对肝脏肾脏的持续性破坏。患IMHA的动物常食欲减退甚至废绝，因此应静脉输注营养物质以补充能量。红细胞溶解会激发白细胞大量生成，应用抗生素（如头孢曲松）可缓解全身炎症反应红细胞大量溶解破坏，产生大量胆红素需要肝脏代谢排出，对肝脏的负担极重，极易造成肝细胞大量损伤。因此应给予护肝药（如科特状、奥普乐等）保护肝脏、增强肝功能[2]。本病例初期进行了大量补液，同时输注营养物质，应对炎症血象、血小板高及生化指标不正常等，采用了抗生素、肝素、护肝药等进行对症治疗。

6.5 预后

IMHA多预后不良，一般情况下，病犬需要长期（通常是终身）进行免疫抑制治疗。该病的复发和加重与停药和减药有关，需长期使用免疫抑制剂防止复发。评估血清胆红素和尿素浓度在预测IMHA犬的预后方面可能是最有用的方法。长期随访的回顾性研究表明，IMHA的复发率为11 % ~ 15 %[13-14]。对于复发的犬：如果复发是在逐渐减少免疫抑制剂的过程中发生的，应增加免疫抑制剂的剂量；如果复发表现为暴发性疾病，应重新开始初始（以前成功的）用药方案；如果复发表现为轻度疾病，则应将免疫抑制药的剂量增加至最近一次减量之前患者接受的最后剂量。症状再次缓解后，应从缓解到第一次减量的时间增加一倍，而在随后的减量之间的时间间隔应加倍。如果尽管采取上述措施仍复发，可能需要终生免疫抑制治疗，力求使用最低剂量的免疫抑制药物来维持缓解[16]。长期使用药物治疗的犬，需要定期进行血液和生化的监测，因为药物可能引起骨髓抑制或肝脏中毒现象。

7 小结

本病例患犬临床表现精神沉郁、食欲不振、四肢无力、高烧、心率加快、呼吸促迫、运动不耐受、尿液呈棕红色等症状，符合IMHA的典型症状。本病例血液学检查可见网织红细胞增多、大量球形红细胞、有红细胞凝集像，生化检查见天门冬酸转氨酶和总胆红素升高。尿常规检查尿胆原、胆红素、酮体、蛋白等值均高。根据以上症状综合诊断此犬患IMHA。

本病例中患犬停药四个月后复发，且各方面血项仍不正常，判断其为预后不良。若再次停药，可能会再度复发并加重病情，因此尽管糖皮质激素长期使用对机体有诸多副作用，仍需要长期用泼尼松龙，控制病情并防止再次复发。

在一项研究试验中，有26 % 的IMHA犬在发病前一个月注射过疫苗[7]，本次接诊的患病犬也于接诊前一个月接诊疫苗，且期间无其他致病因素存在，因此强烈怀疑IMHA是疫苗继发。

注射疫苗后一些个体出现不良反应，如注射部位局部红肿、乏力、食欲不振和发烧等，部分个体可能出现过敏反应。正常情况下注射疫苗引起IMHA却极为少见。发生机理可能是，疫苗中的抗原与机体改变的红细胞抗原决定簇结合，产生抗自身红细胞抗体，或疫苗中变应原激发机体产生特异性IgM或IgG，与吸附于红细胞表面外来抗原成分或红细胞自身抗原发生特异性结合，促使I型变态反应的发生，红细胞受损裂解，或细胞毒作用杀伤红细胞，导致溶血[17]。

疫苗引起的溶血性贫血病例在人类临床和兽医临床上都少见，并不能因此怀疑疫苗的安全性，但可以在接种疫苗前进行个体评估，以降低一系列风险，预防此类不良反应的发生，并采取各种有效措施，减轻不良反应引起的后果。