基于石墨烯/壳聚糖修饰电极的免疫传感器检测噻虫啉

赵国政，张 芹，解廷月

(1.山西师范大学现代文理学院，山西临汾 041000;2.南京师范大学化学与材料科学学院，江苏南京 210023;3.山西大同大学物理与电子科学学院，山西大同 037009)

烟碱类农药有吡虫啉、噻虫啉、噻虫嗪、呋虫胺及烯啶虫胺等，其中，噻虫啉（thiacloprid，图1）是继吡虫啉之后拜耳公司开发的又一烟碱类广谱内吸性杀虫剂，对刺吸式口器害虫具有高效杀虫作用[1−2]。近年来，由于农药管理监督力度不够，滥用农药现象较严重。因此，迫切需要寻找噻虫啉快速准确的检测技术，研究意义重大。

图1 噻虫啉的分子结构

随着新型材料石墨烯的问世[3]，石墨烯与其它材料制备的复合物引领了研究热潮，壳聚糖修饰的石墨烯复合材料便是其中一种[4]。Yin 等[5]运用壳聚糖修饰石墨烯，建构了检测水样中邻苯二酚（CT）、间苯二酚（RS）和对苯二酚（HQ）的电化学生物传感器，具有较宽的线性范围和较低的检测限。Kang 等[6]基于石墨烯−壳聚糖复合物制备了葡萄糖传感器，成功实现了对葡萄糖的检测，展现出了优良的检测性能。

基于所研制的石墨烯/壳聚糖/噻虫啉电化学免疫传感器，结合噻虫啉抗体与抗原间的特异性竞争反应，采用循环伏安法（CV）和差分脉冲伏安法（DPV），在K3Fe(CN)6溶液中实现对噻虫啉的检测。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

CHI852C电化学工作站（上海辰华仪器公司）；噻虫啉抗体（南京晓庄学院）；噻虫啉（Sigma−Aldrich 公司）；壳聚糖（Sigma−Aldrich 公司）；磷酸缓冲溶液（ThermoFisher公司）；实验用水为二次蒸馏水。

1.2 免疫传感器的制备

噻虫啉溶液的制备：称取0.05 g噻虫啉，溶于10 mL DMF中，配得0.5 g/L噻虫啉溶液，稀释至0.2 g/L。

将5 mg石墨烯[7]溶解于2.5 mL 壳聚糖溶液，得到石墨烯/壳聚糖分散液。

将电极（GCE）依次在直径为0.3和0.05µm Al2O3抛光粉上打磨，分别在无水乙醇−蒸馏水、蒸馏水中各超声清洗5 min，蒸馏水冲洗，在2 mmol K3Fe(CN)6中扫CV图，以电势差在100 mV以内为标准，衡量电极是否打磨完好。将打磨好的电极放在室温下，晾干。

将4µL 石墨烯/壳聚糖分散液滴涂到电极上，再将2µL 0.2 g/L 噻虫啉溶液滴涂于电极表面，40 ℃烘干。修饰过的电极浸泡在5%的牛血清白蛋白（BSA）溶液中，37 ℃烘箱中孵育30 min。

1.3 香蕉/西红柿样品的前处理

称取2.000 g 香蕉/西红柿于10 mL 样品管中，加入噻虫啉溶液和3 mL 乙腈提取液，超声振荡30 min，离心10 min（2 000 r/min），将上清液转移至样品管。50 ℃氮气吹干，1 mL pH=7.4 磷酸缓冲溶液（PBS）加入样品管，溶解浓缩物。

1.4 电化学检测

工作电极、参比电极与辅助电极分别为石墨烯/壳聚糖/噻虫啉修饰电极、Ag/AgCl 电极与铂丝电极，运用CV探讨不同程度修饰电极的电化学行为。

2 结果与讨论

2.1 免疫传感器检测噻虫啉的原理

原理如图2 所示:①石墨烯/壳聚糖/噻虫啉电极浸入噻虫啉抗体和游离噻虫啉的孵育液时，固定在电极上的噻虫啉、溶液中游离的噻虫啉分别竞争结合噻虫啉抗体；②噻虫啉和噻虫啉抗体之间存在特定的竞争反应，从而使抗体在电极上发生吸附；③所形成的抗体−抗原复合物致使电极产生位阻，降低峰值电流。基于电化学信号的差异，实现噻虫啉的定量检测。

图2 石墨烯/壳聚糖/噻虫啉修饰电极的免疫传感器检测噻虫啉原理

2.2 实验条件的优化

DPV 法确定孵育液中免疫反应的时间。将一定体积的抗体依次孵育0，10，20，30 和40 min，PBS 冲洗。由图3 可知，对于石墨烯/壳聚糖/噻虫啉修饰电极的DPV 峰电流随孵育时间的变化趋势，前20 min，电流值快速下降，20～40 min范围内，下降幅度较小。孵育时间再增加电流值降低很少。因此，选择20 min作为免疫反应的时间。

图3 不同孵育时间下的DPV峰值电流

孵育液中抗体浓度的优化。图4 展示了不同抗体浓度与DPV 峰值电流的对应关系。从图中可知，抗体体积由0 µL 到5 µL 时，DPV 峰值电流显著下降。随着抗体体积的继续增加，5～15µL 之间，电流值变化很小。因此，选择5µL作为反应的抗体体积。

图4 不同抗体含量下的DPV峰值电流

2.3 噻虫啉的检测

孵育液体积总量为50µL，是含一系列不同浓度噻虫啉溶液、PBS及相同浓度噻虫啉抗体的溶液。图5 展示了石墨烯/壳聚糖/噻虫啉电极在不同浓度孵育液中的DPV 曲线。从图中可知，DPV 峰值电流随噻虫啉在孵育液中的浓度增加而增大。定义修饰电极在含5 µL 抗体的PBS 缓冲溶液孵育后对应的响应电流为I0，在含有游离噻虫啉的孵育液孵育后对应的响应电流为Ix，电流变化ΔI（ΔI=Ix−I0）与噻虫啉浓度在500～6 000 µg/L 范围内成正比，检出限为0.4 µg/L。

图5 不同浓度孵育液中石墨烯/壳聚糖/噻虫啉电极的DPV电流

2.4 重复性与稳定性

对石墨烯/壳聚糖/噻虫啉免疫传感器重复6次，DPV 扫描，峰值电流变化的相对标准偏差小于5.5%，说明传感器具有较好的实验重复性。

将石墨烯/壳聚糖/噻虫啉免疫传感器存放于空气中，DPV 扫描，峰值电流5 d 内下降值低于5.8%，说明传感器具有较好的稳定性。

2.5 香蕉样品的分析

对3 种加入不同量噻虫啉溶液的香蕉样品进行检测，每个浓度检测3 次，基于标准曲线，噻虫啉的回收率为93.2%～ 102.4%，平均为98.2%，见表1。

表1 香蕉样品加标处理检测噻虫啉实验结果

2.6 西红柿样品的分析

对3 种加入不同量噻虫啉溶液的西红柿样品进行检测，每个浓度检测3 次，基于标准曲线，噻虫啉的回收率为97.4%～ 103.9%，平均为100.3%，见表2。

表2 西红柿样品加标处理检测噻虫啉实验结果

3 结论

制备的新型石墨烯/壳聚糖/噻虫啉电化学免疫传感器，能将石墨烯材料优异的导电性能和较大的比表面积、壳聚糖的吸附特性和对石墨烯良好的分散效果进行结合，与抗原（噻虫啉）共同修饰于玻碳电极上，实现对噻虫啉的检测。响应电流的降低与噻虫啉在500～ 6 000 mg/L 范围内成正比，检测限为0.4 g/L。此免疫传感器用于香蕉和西红柿中噻虫啉的检测具有良好的回收率。