黑枸杞花青素的提取及其抗氧化性分析

刘玉玲 张秋红 徐帆

摘要：黑枸杞作为原料，用超声辅助法提取黑枸杞花青素，设计单因素实验和正交试验来探究黑枸杞花青素提取的最适条件。结果表明：提取黑枸杞花青素最佳的工艺条件是1%HCL提取溶剂和70%C2H5OH之比为50：50，温度为40℃，超声波提取时间为45min，超声波提取功率为480W，料液比为1：40（g/ml）。黑枸杞花青素具有较强清除DPPH的能力，且高于对照组VC，黑枸杞花青素对·OH也有较强清除作用，只是黑枸杞花青素的清除能力没有VC的清除能力强。

关键词：黑枸杞;花青素;抗氧化;超声波提取;正交试验

1 材料

1.1 试验原料与试剂

黑枸杞（粉碎、干燥）。

70%C2H5OH、HCL溶液、C2H4O2溶液、KCL溶液、CH3COONa溶液、DPPH·溶液、C7H6O3溶液、FeSO4溶液、H2O溶液、VC溶液（均为分析纯）。

1.2 试验仪器

starter3C实验室pH计：奥豪斯仪器（上海）有限公司;RHP-2000A粉碎机：浙江荣浩股份有限公司;HH-4数显恒温水浴锅：金坛市友联仪器研究所;DHCT-9140A电热恒温鼓风干燥箱：上海精宏实验设备有限公司;TCL-16高速离心机：金坛市恒丰仪器厂;TGL-16aR高速冷冻离心机：上海安亭科学仪器厂;752紫外分光光度计：上海佑科仪器仪表有限公司。

2 试验方法

2.1 黑枸杞花青素超声波提取工艺流程

黑枸杞清洗→烘干、粉碎→过筛→称取黑枸杞粉末→超声波提取（加入乙醇）→抽滤→高速离心→浓盐酸调至pH =1→重复提取3次→合并提取液→冷冻离心→黑枸杞花青素提取液。

2.2 黑枸杞花青素单因素试验设计

黑枸杞作为原料，在吸收波长为525nm处，超声辅助提取的条件下，进行单因素试验，单因素分别为提取剂、温度、时间、料液比和超声功率。

黑枸杞花青素单因素的确定：

准确称取1.0g干燥粉碎过的黑枸杞，初步设定花青素的提取料液比1：30（g/m L），提取温度60℃、超声波功率360W、提取时间30 min、提取剂0.1%HCL与70%乙醇之比为50∶50，保持其中四个因素不变，改变一个因素，重复操作实验五次，确定出提取黑枸杞花青素的最佳提取料液比、溫度、超声波功率、提取时间、以及提取剂0.1%HCL与70%乙醇之比。

2.3 黑枸杞花青素正交试验设计

在单因素试验的基础上，计算出五个单因素中对黑枸杞花青素提取影响效果较大的前四个单因素，分别为A（温度）、B（时间）、C（功率）、D（料液比）四因素来进行四因素三水平试验。

2.4 黑枸杞中花青素的测定

缓冲溶液的配置：pH1.0缓冲溶液：4.0ml0.5mol/L氯化钾溶液、2.0ml0.5mol/L盐酸溶液，避光放置备用。pH4.5缓冲溶液：量取9.8ml的C2H4O2，称取CH3COONa18g，用去离子水定容至1000ml容量瓶中，避光放置。

吸取1ml花青素提取液，移液至50ml的容量瓶中，用配置好的pH1.0的缓冲溶液定容，避光平衡90min，用分光光度计测量吸光值;再取花青素提取液1ml，用50ml容量瓶以pH4.5的缓冲溶液定容，避光静置平衡90min，测定其吸光值;按公式（1-1）代入数值计算结果，得出花青素含量。

（1-1）

式中：ΔT-p H 1.0缓冲溶液的吸光值和pH 4.5的缓冲溶液的吸光值的差值;V-为花青素提取液被缓冲溶液稀释的体积数，L：F-为花青素提取液被缓冲溶液稀释的倍数;M1-449.2，即矢车菊素-3-葡萄糖苷的相对分子质量;ε-29600，即矢车菊素-3-葡萄糖苷的摩尔消光系数;M2-称取黑枸杞的重量，g。

2.5 黑枸杞花青素对二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除测定

（1）以无水C2H5OH配制溶液浓度为0.1mol/L DPPH·，避光放置。

（2）将花青素提取液稀释为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35mg/ml溶液。量取不同梯度提取液1ml，分别与5mlDPPH·溶液均匀混合，放置暗处平衡30 min，在525nm处测定吸光值，按公式（1-2）计算DPPH·清除率。

清除率=（WA-WB）/WA×100%（1-2）

式中WA：为DPPH·溶液和去离子水的吸光值;WB为DPPH·溶液和花青素混合溶液的吸光值。

（3）避光快速称取维生素C粉末，加入去离子水把维生素C溶解稀释，配制浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35 mg/ml维生素C溶液，按照（2）操作，绘制维生素C曲线。

2.6 黑枸杞花青素水杨酸法对羟基自由基（·OH）清除率测定

（1）利用水杨酸法测定羟基自由基（·OH）被花青素清除的清除率，用去离子水把花青素提取液依次稀释，配置浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35 mg/ml。采用水杨酸法[8]37℃条件下，水浴15 min，在525nm下测其吸光值，按照下式（1-3）计算·OH清除率

（1-3）

式中A样品：为样品的吸光值;A空白：为不加显色剂H2O2吸光值;A对照：为空白对照的吸光值。

（2）称取维生素C粉末，加入去离子水把维生素C溶解稀释，配制浓度为0.05、0.10、0.15、0.20、0.25、0.30和0.35 mg/ml维生素C溶液，按照（1）操作，绘制维生素C曲线。

3 结果与分析

3.1 单因素对黑枸杞花青素提取效果的影响

3.1.1 提取溶剂对黑枸杞花青素提取量的影响

提取率随着1%盐酸和70%乙醇比例的增加先增加后减少，在1%盐酸和70%乙醇只比為50：50时，提取率最高。提取剂的最优选择为60%C2H5OH，而试验采用的是酸化C2H5OH，目的是调节pH值，以达到提取花青素的最适提取条件。

3.1.2 料液比对黑枸杞花青素提取量的影响

花青素提取率随着料液比的增加而逐渐增加，随后趋于平稳。在物液比为1：30（g/ml）时，可以明显看出提取高峰值，花青素提取率效果最好。结合文献巩芳芳等人研究结果对比可知，研究结果一致。

3.1.3 提取温度对黑枸杞花青素提取量的影响

花青素提取率随着温度的升高，提取率先升高后降低，黑枸杞花青素在温度为50℃时，提取率最高。由文献可知花青素结构具有不稳定性，较高的温度会破坏花青素的结构，从而降低了花青素的提取率。结合文献崔逸，蒋彩云，张翔等人的研究结果对比可知，结果一致。

3.1.4 提取时间对黑枸杞花青素提取量的影响

花青素提取率随着提取时间的延长，提取率先升高后降低，当时间在45min时，提取率最高。结合文献张玲艳的研究结果可知，最佳提取时间为25min，与试验结果有偏差，综合分析可知，张玲艳的提取方法为乙醇提取法，本试验采用到酸化乙醇提取法，需时间稍长一些使其充分提取，以达到最大提取量。

3.1.5 超声波功率对黑枸杞花青素提取量的影响

花青素含量随着超声波功率的增大，提取率先显著升高后显著降低，在超声功率360W时，提取率最高。当提取功率慢慢增加，会对提取的花青素有一定影响，使之发生热效应，而热效应会阻碍花青素的提取。不过随着时间的延长，溶液中的花青素会与蛋白纤维发生反应，两者聚集结合，就又会被提取出来，所以提取率也会发生变化，慢慢升高。可知，试验结果的可行性无问题。

3.1.6 正交试验

根据正交试验分析可知，最优组合方案是A1B3C3D3，为提取花青素温度40℃，提取花青素时间45min，提取花青素功率480W，提取花青素料液比

1：40时，黑枸杞花青素的提取率最高。通过对最优组合的验证试验，吸光值为0.493高于正交试验的最高吸光值0.474，所以该组合为最优组合方案。四因素的主要影响次序为A>B>D>C，即温度>时间>料液比>功率。

3.2 花青素在黑枸杞中的含量

通过正交试验的最优组合，取得提取率最高的花青素提取液，通过计算可知，黑枸杞中花青素含量为168mg/100g。结合文献可知，在正常范围内，结果一致。

3.3 黑枸杞花青素抗氧化性的研究

3.3.1 对二苯代苦味酰基自由基（DPPH·）的清除能力

随着浓度的增加，VC和花青素提取液对DPPH·的清除能力都呈上升趋势，但同浓度的情况下，VC的清除效果没有花青素的清除效果显著，在浓度在0.35时，花青素对清除率为90%，而VC的清除率只有百分之七十，所以，对DPPH·的清除能力花青素大于VC。

3.3.2 对羟基自由基（·OH）清除率测定

随着浓度的增加，VC和花青素提取液对·OH的清除能力都呈上升趋势，可在同等浓度的下，花青素清除·OH的能力远不如VC，当浓度在0.35时，VC对·OH几乎彻底被VC清除，而花青素对·OH的清除率仅为百分之六十，显然对·OH的清除能力VC大于花青素。有学者发现，紫甘薯花青素在体外活性氧模型中表现出较强的还原力和清除羟基自由基的能力，并且随着质量浓度的增加而增加，与试验结论保持一致。

4 结论

黑枸杞花青素提取最佳工艺条件为提取溶剂1%HCL和70%C2H5OH比为50：50，温度为40℃，超声波提取时间为45min，超声波提取功率为480W，花青素提取料液比值为1：40（g/ml）。

黑枸杞花青素具有较强清除DPPH·和·OH的能力，随着黑枸杞花青素浓度的增加，清除能力越来越强，只是花青素的清除·OH能力没有维生素C的清除能力强。总的来说黑枸杞花青素具有较强的抗氧化性。

参考文献

[1] 杨斌，王向未.黑枸杞及其功能性成分在食品工业中的应用及开发进展[J].轻工科技，2014，30（10）：22-23.

[2] 闫亚美，罗青，冉林武，等.黑果枸杞功效研究进展及产业发展前景[J].宁夏农林科技，2015，56（01）：21-24，57.