竹笋壳提取物对膜璞毕赤酵母及其生物膜的抑制作用

龚川杰，胡容，吕远平，何强，迟原龙

(四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065)

传统发酵调味品，如四川泡菜，在贮藏期间经常出现“生花”现象。“生花”是在泡菜表面形成的生物膜，常导致盐水浑浊、菜品软烂和馊臭[1]，造成原材料浪费和经济损失。已有研究表明膜璞毕赤酵母是导致发酵食品表面形成生物膜的主要菌株之一[2]。竹笋壳是食品加工中的下脚料，产量大、价值低，多废弃[3]。竹笋壳提取物已被证实具有抑菌活性[4-6]，但其对于“生花”酵母及生物膜的抑制作用报道较少[7]。本研究以膜璞毕赤酵母为目标菌，考察了3种竹笋壳提取物的抑菌特性和抑制生物膜特性，探讨了竹笋壳对四川泡菜生花的影响。本文研究结果可为竹笋壳类天然防腐剂的开发提供基础依据，为竹笋壳资源的高值化利用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

毛竹笋：收获于2020年5月，购于当地农贸市场；膜璞毕赤酵母：分离自四川泡菜盐卤表面膜璞，实验室自存；芦丁、福林-酚试剂、考马斯亮蓝G250、没食子酸：购于成都市科隆化学品有限公司；酵母浸出粉胨葡萄糖培养基(YPD)：购于青岛海博生物技术有限公司；其他化学试剂：均为国产分析纯；萝卜、食盐：购于当地农贸市场。

1.2 主要实验仪器

SpectraMax M2型微孔板测读仪 Molecular Devices仪器(上海)有限公司；Nikon Ts2型倒置显微镜 上海千欣仪器有限公司；Biosafer-10C型冷冻干燥机 美国Labconco公司；UV-1100型紫外可见分光光度计 上海美谱达仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 竹笋壳提取物的制备

将新鲜的竹笋壳清洗、切块，采用组织粉碎机打浆，经纱布过滤后收集竹笋壳渣，再采用冷冻干燥得到竹笋壳打浆物(DJ)；取50 g竹笋壳渣加入至500 mL蒸馏水中，在40 ℃下搅拌提取2 h，过滤后收集提取液，经减压浓缩、冷冻干燥后得到竹笋壳水提物(ST)，称重并计算得率；采用无水乙醇替代水作为提取溶剂，其他提取工艺和条件同上，得到竹笋壳醇提物(CT)，上述3种提取物置于干燥器中贮藏，备用。

1.3.2 竹笋壳提取物中主要化学成分的测定

采用蒽酮比色法测定提取物中可溶性糖的含量[8]，采用考马斯亮蓝比色法测定可溶性蛋白质的含量，采用硝酸铝显色法测定黄酮的含量[9-10]，采用福林酚比色法测定多酚含量。

1.3.3 竹笋壳提取物对膜璞毕赤酵母抑制作用的测定

配制浓度为2×103CFU/mL膜璞毕赤酵母菌悬液和100 mg/mL 3种竹笋壳提取物水溶液，分别取适量菌悬液和提取物水溶液至96孔板中混合均匀，使其中目标菌浓度为103CFU/mL，且竹笋壳提取物浓度为6.25～50 mg/mL，以浓度为103CFU/mL的菌液为空白对照。在28 ℃静置培养24 h，通过肉眼观察孔板中混合液是否出现浑浊确定3种提取物的最低抑菌浓度(MIC)。将培养后的提取物——目标菌混合液涂布于YPD固体平板，在28 ℃静置培养48 h后计数，则抑菌率(%)=[(对照组菌落数-处理组菌落数)/对照组菌落数]×100。

分别取适量菌悬液和提取物水溶液至96孔板中混合均匀，使其中目标菌OD值为0.15，且3种竹笋壳提取物浓度为各自MIC，以未加入提取物溶液的菌液为空白对照，测定3种提取物对目标菌的抑菌动力学曲线。

1.3.4 竹笋壳提取物对膜璞毕赤酵母菌生物膜的抑制和消除作用的测定

依据Perpetuini等[11]的方法测定3种提取物对目标菌生物膜的抑制和消除作用。生物膜抑制实验：配制浓度为106CFU/mL膜璞毕赤酵母菌悬液和100 mg/mL 3种竹笋壳提取物水溶液，分别取适量菌悬液和提取物水溶液至96孔板中混合均匀，使其中目标菌浓度为105CFU/mL，且3种提取物浓度为各自MIC，以未加入提取物溶液的菌液为空白对照。在28 ℃静置培养24 h，经甲醇固定、结晶紫染色、无菌水洗涤、冰乙酸洗脱后，测定洗脱液于600 nm处的吸光度值。

生物膜消除实验：取适量菌悬液与无菌水混合使目标菌浓度为105CFU/mL，在28 ℃静置培养24 h，菌液表面形成生物膜后，再加入适量提取物水溶液至菌液中混匀，使3种提取物浓度为各自MIC，以未加入提取物溶液的菌液为空白对照。再于28 ℃静置培养24 h，经固定、染色、洗涤、洗脱后，测定洗脱液于600 nm处的吸光度值。生物膜抑制率或消除率(%)=[(对照组OD值-处理组OD值)/对照组OD值]×100。

利用光学倒置显微镜观察生物膜抑制实验中竹笋壳水提物(25 mg/mL)对膜璞毕赤酵母生物膜的抑制作用，放大倍数为10×40，以未加入提取物的菌液为对照样。

1.3.5 竹笋壳对四川泡菜“生花”的抑制实验

取500 g萝卜洗净、切分，浸渍于装有煮沸冷却食盐水的4 L泡菜坛中，加入40 mL老泡菜母液并混匀，通过添加适量食盐使泡菜盐水的平衡盐度为4%(W/V)，坛口加水密封后于室温条件下存放2 d，此时泡菜已发酵成熟(pH约为3.5)。实验组将膜璞毕赤酵母菌悬液加入成熟泡菜中，同时加入200 g竹笋壳小块2 cm2；对照组仅加入膜璞毕赤酵母菌悬液。两组样品均在室温条件下放置14 d，比较观察竹笋壳对四川泡菜“生花”的影响。

1.3.6 数据分析

采用SPSS Statistics 19.0对实验数据进行方差分析，显著性水平P<0.05，应用Origin 9.0进行数据作图。

2 结果与分析

2.1 3种竹笋壳提取物的得率和主要化学成分

竹笋壳打浆物、水提物和醇提物的得率分别为5.71%、3.72%、4.02%。其中竹笋壳醇提物具有较高的黄酮和多酚含量，竹笋壳水提物中多酚含量最高(P<0.05)。营养物质可溶性糖和可溶性蛋白在竹笋壳打浆物中分别达到了55.73 mg/g和24.52 mg/g[12]，与其余两种提取物相比差异显著(P<0.05)。

表1 3种竹笋壳提取物的主要化学成分Table 1 The main chemical components of three extracts from bamboo shoot shells

2.2 3种竹笋壳提取物的抑菌活性

3种竹笋壳提取物对膜璞毕赤酵母均表现出一定的抑制作用，见图1。

图1 3种提取物在不同浓度下对目标菌的抑菌率Fig.1 The inhibition rates of the three extracts with different content against P. membranifaciens

由图1可知，随着提取物浓度的增加，3种提取物的抑菌作用逐渐增强。当提取物浓度达到12.5 mg/mL及以上时，3种提取物的抑菌率均达到50%以上，其中竹笋壳醇提物的抑菌活性最强，其在浓度高于25 mg/mL时可以达到对目标菌的完全抑制，3种提取物的抑菌动力学曲线见图2。

图2 3种提取物对目标菌的抑菌动力学曲线Fig.2 The inhibitory kinetics curves of the three extracts against P. membranifaciens

由图2可知，加入提取物的菌悬液OD值随着培养时间的延长增长较缓慢，当培养48 h时OD600 nm值均低于0.8(空白组OD600 nm值约为1.6)，表明3种提取物对目标菌有较强的抑制作用，其中竹笋壳醇提物的抑菌活性最强，这可能与其黄酮和多酚含量高有关。有研究证实100～200 mg/mL的竹笋壳醇提物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的抑制作用能达到山梨酸钾的效果[13]。也有研究得出竹笋壳提取液对泡菜中的“生花”酵母有抑制作用。

2.3 3种竹笋壳提取物的抑制生物膜活性

表2 3种竹笋壳提取物对膜璞毕赤酵母的最小抑菌浓度(MIC)及对其生物膜的抑制与消除作用Table 2 The minimum inhibitory concentration (MIC) of the three extracts from bamboo shoot shells on P. membranifaciens and their inhibition and elimination effects on its biofilm

由表2可知，竹笋壳水提物和醇提物在其MIC浓度下对生物膜形成的抑制率均达到70%以上，但其消除生物膜的效果较差(不足或接近10%)。

对照组中成熟生物膜呈致密的网状结构，见图3中B。加入浓度为25 mg/mL的竹笋壳水提物后，抑制了黏附细胞从酵母相转变为菌丝相，生物膜中的孔隙和管道系统被破坏，菌丝的形成明显减少，破坏了生物膜结构的完整性，见图3中A。

图3 添加25 mg/mL竹笋壳水提物处理组(A)和空白对照组(B)下膜璞毕赤酵母形成生物膜的形态观察(10×40)Fig.3 The morphology observation of biofilm of P.membranifaciens in the treatment group with25 mg/mL aqueous extracts of bamboo shootshells (A) and blank control group (B)

综合上述研究结果，推测竹笋壳提取物主要与目标菌直接作用从而抑制生物膜形成，可能的作用机理有：减少体系中浮游产膜菌的数量；通过修饰改变表面性质，阻碍浮游细胞的黏附和聚集；下调生物膜主要组成物质如菌丝、多糖、蛋白质、核酸的相关表达基因，降低生物膜形成能力。

2.4 竹笋壳对四川泡菜“生花”的影响

表3 四川泡菜发酵过程中pH和盐度Table 3 The pH values and salt concentration of Sichuan pickles during fermentation

图4 竹笋壳对四川泡菜“生花”的影响Fig.4 The effect of bamboo shoot shells on the “biofilm formation” of Sichuan pickles

由表3和图4可知，乳酸菌在发酵前2 d快速生长产生乳酸，对照组和实验组的pH分别降至3.50和3.24，表明泡菜成熟。对照组在发酵至14 d的过程中，以膜璞毕赤酵母为主的微生物形成白色碎花状生物膜，膜璞逐渐褶皱变厚，泡菜水浑浊，pH升高至4.16，泡萝卜特有的酸香风味减弱。加入竹笋壳的四川泡菜中未出现生花现象，泡菜水清亮，泡菜酸香风味浓郁，表明竹笋壳的加入可有效抑制四川泡菜生花。此外，对照组和实验组盐浓度由初始的4%逐步降低至3.64%和3.48%，这可能与泡菜中的有机质被分解，组织液渗透进盐水中有关。

3 结论

竹笋壳水提物和醇提物对膜璞毕赤酵母具有一定的抑制作用。在最小抑菌浓度下，竹笋壳水提物和醇提物可以有效抑制膜璞毕赤酵母形成生物膜，抑制率分别达到(81.76±1.31)%和(71.31±1.56)%，但这两种提取物对目标菌生物膜的消除作用较弱。本研究提出了一种利用竹笋加工副产物制备天然防腐剂的方法，可为其他农产品加工副产物的再利用和传统发酵食品和调味品的防腐保质提供参考。