复合植物活性成分对产气荚膜梭菌感染肉鸡生长性能和肠道组织形态的影响

■孟禹璇 刘 阳 张 钊 宁 楠 汪曼丽 郭双双 丁斌鹰 侯永清

（武汉轻工大学动物营养与饲料科学湖北省重点实验室，湖北武汉 430023）

产气荚膜梭菌（Clostridium perfringens，CP）是一种厌氧型革兰氏阳性菌，会引起肉鸡坏死性肠炎[1]。在饲粮中添加抗生素是目前预防和控制坏死性肠炎的主要措施，但滥用抗生素造成的负面影响引起了社会各界的高度重视，因此研发安全高效的绿色投入品已成为畜禽生产的关键问题。植物活性成分是一类从植物中提取出的生物活性物质，包括植物精油、黄酮、多酚、多糖、生物碱、皂苷、单宁、有机酸等[2]，动物机体摄入的植物活性成分可被胃肠壁完全吸收，在体内参与代谢调控后以安全产物形式排出体外，不损伤动物机体，且不危害环境[3]，并且大部分植物活性成分都有杀菌、抑菌[4]、防霉、驱虫及抗氧化[5]等功能。当前，植物活性成分在养殖业上的应用较多，但其种类繁多、成分复杂，存在作用机制不清楚、效果不稳定等问题。本研究以产气荚膜梭菌感染肉鸡为动物模型，研究复合植物活性成分对肉鸡生长性能和肠道组织形态的影响，为复合植物活性成分在实际生产中的应用提供理论依据和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料与基础日粮

A型产气荚膜梭菌CVCC2030购自中国兽医微生物菌种保藏管理中心。试验所用复合植物活性成分由肉桂醛、丁香酚、柠檬醛和月桂酸单甘酯按质量1∶2∶1∶4配比组成，所用复合植物活性成分均购于上海阿拉丁生化科技有限公司。基础饲粮为玉米-豆粕型，参照中国鸡饲养标准（2004）配制，基础饲粮组成和营养水平见表1。

表1 基础饲粮组成和营养水平（风干基础）

1.2 试验设计

本试验选取264只1日龄健康的科宝肉鸡母雏（购自湖北荆州正康家禽公司），采用2×2双因素设计，随机分为4个处理，分别为对照（CON）组、产气荚膜梭菌感染（CP）组、复方组、复方+产气荚膜梭菌感染（复方+CP）组，每个处理6个重复（笼），每个重复11羽，试验期为30 d。对照组和产气荚膜梭菌感染组饲喂基础饲粮，复方组和复方+产气荚膜梭菌感染组在基础日粮的基础上添加400 mg/kg复合植物活性成分。复方产气荚膜梭菌的感染方式参考Du等[6]建立的方法，CP组和复方+CP组肉鸡于第17～23日龄连续经口接种培养时间为16 h的A型产气荚膜梭菌新鲜悬浮液（1×108CFU/mL），每只鸡每天接种1 mL。同时对照组和复方组肉鸡灌喂相同剂量不含产气荚膜梭菌的灭菌肉汤培养基。

1.3 饲养管理

肉鸡采用网上平养的方式，鸡舍和试验所用的设备均进行彻底的消毒灭菌处理。自由采食和饮水，进行常规免疫接种，定期打扫并消毒。试验第1周鸡舍温度控制在32～34℃，第2周在30～32℃，第3周至试验结束鸡舍温度控制在26℃左右，采用连续光照。鸡舍湿度为50%～60%。

1.4 样品采集

在试验第23 d和30 d，分别从每个重复随机抽取2只肉鸡，翅下静脉采血2 mL，待血清析出后，3 000 r/min离心10 min，取上清分装，于-80℃冰箱保存待测。颈动脉放血致死后在无菌条件下打开腹腔，取十二指肠、空肠、回肠中段各1 cm于预冷的4%多聚甲醛中固定。另取空肠、回肠中间部分（长约10 cm），剖开肠段后用预冷的无RNA酶水冲洗肠道内容物，刮取肠黏膜，置于无RNA酶离心管中，液氮速冻后转移至-80℃冰箱中保存待测。

1.5 测定指标与方法

1.5.1 生长性能

分别于试验第0、17、23 d和30 d以重复（笼）为单位对试验鸡进行空腹称重（称重前8 h断料不断水），计算平均日增重、平均日采食量、料重比。每天记录各组肉鸡的健康情况。

1.5.2 肠道形态的测定

固定肠道组织样送往武汉博士德生物工程有限公司进行石蜡包埋，制作HE染色切片。肠道组织切片用OLYMPSBX-41TF型光学显微镜观察，采用HPI⁃SA-1000高清晰彩色病理图文报告分析系统进行图片采集，每张切片选择10个走向平直且相对完整的绒毛，测量所选绒毛高度（Villus height，VH）及其对应的隐窝深度（Crypt depth，CD），并计算绒毛高度与隐窝深度的比值（V/C），取10根绒毛数据的平均值作为此切片的最终测量值[7]。

1.5.3 肠黏膜屏障基因mRNA相对表达量的检测

将空肠和回肠黏膜样品于液氮中研磨，采用RNAiso Plus试剂（TaKaRa，大连）提取各样本的总RNA，RNA的浓度和纯度用Nanodrop进行测定。根据PrimeScript®RT reagent Kit with gDNA Eraser试剂盒（TaKaRa，大连）的方法，取1μg RNA进行反转录，合成cDNA。采用SYBR®Premix Ex TaqTM试剂盒（TaKa⁃Ra，大连）在实时荧光定量PCR仪（ABI 7500，Thermo⁃Fisher Scientific，美国）上进行基因表达测定。检测的免疫相关基因屏障结构相关基因为闭合蛋白（Occlu⁃din）、紧密连接蛋白-1（Claudin-1）、紧密连接蛋白-2（Claudin-2）、黏蛋白-2（Mucin-2）、黏蛋白-5ac（Mu⁃cin5ac）、三叶因子-2（TFF-2）、钙黏附蛋白-E（E-cad⁃herin）。以β-actin为内参基因，以对照组为参照，采用2-ΔΔCt法计算基因的相对表达量。基因的引物序列见表1，引物由宝生物工程（大连）有限公司合成。

表2 基因的引物序列

1.6 统计分析

试验数据除0～17日龄生长性能采用T检验，其他数据采用SPSS 21.0统计分析软件进行双因素方差分析，采用邓肯氏多重比较进行组间分析。P<0.05为差异显著，试验结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 复合植物活性成分对产气荚膜梭菌感染肉鸡生长性能的影响（见表3）

由表3可知，在0～16日龄和24～30日龄各组生长性能均无显著差异（P>0.05)。在17～23日龄，添加复合植物活性成分与产气荚膜梭菌感染对肉鸡平均日增重具有交互作用（P<0.05），CP组平均日增重显著低于其他三组（P<0.05)。

表3 复合植物活性成分对产气荚膜梭菌感染肉鸡生长性能的影响

2.2 复合植物活性成分对产气荚膜梭菌感染肉鸡肠道组织形态的影响（见表4）

由表4可知，在第23日龄，感染产气荚膜梭菌显著降低十二指肠绒毛高度与隐窝深度的比值（V/C）和空肠隐窝深度（P<0.05），添加复合植物活性和产气荚膜梭菌对肉鸡回肠绒毛高度和V/C比值具有交互作用（P<0.05），与CON组相比，复方组显著降低了绒毛高度和V/C值。在第30日龄，感染产气荚膜梭菌显著降低回肠绒毛高度和V/C值，添加复合植物活性成分显著增加空肠绒毛高度和V/C值。添加复合植物活性和产气荚膜梭菌对肉鸡第30日龄回肠隐窝深度具有交互作用（P<0.05），CP组绒毛高度显著低于其余三组。

表4 复合植物活性成分对产气荚膜梭菌感染肉鸡肠道组织形态的影响

2.3 复合植物活性成分对产气荚膜梭菌感染肉鸡肠道屏障基因表达的影响（见表5）

由表5可知，在第23日龄，产气荚膜梭菌感染显著下调了空肠Claudin-2和TFF-2及回肠TFF-2的相对表达量（P<0.05），显著上调了空肠Mucin-2的相对表达量（P<0.05）。添加复合植物活性成分显著上调了空肠Mucin-2和Mucin5ac及回肠TFF-2和Mucin5ac的相对表达量（P<0.05），显著下调了空肠TFF-2和回肠Claudin-2的相对表达量（P<0.05）。添加复合植物活性和产气荚膜梭菌对肉鸡空肠Occludin、E-cadherin和Claudin-1表达量具有交互作用（P<0.05）；与CON组相比，复方组和CP组显著下调了Occludin和E-cadherin的相对表达量（P<0.05）。复方组肉鸡空肠Claudin-1 mRNA表达量高于其他三组。添加复合植物活性和产气荚膜梭菌对肉鸡回肠Occludin、E-cadherin和Mucin-2表达量具有交互作用（P<0.05）；复方组肉鸡回肠Oc⁃cludin和E-cadherinmRNA表达量显著低于其他三组，复方+CP组肉鸡回肠Mucin-2 mRNA表达量显著高于其他三组。

表5 复合植物活性成分对产气荚膜梭菌感染23日龄肉鸡肠道屏障与免疫基因的相对表达量

3 讨论

3.1 复合植物活性成分对产气荚膜梭菌感染肉鸡生长性能的影响

本试验将肉桂醛、丁香酚、柠檬醛和月桂酸单甘酯进行复合饲喂肉鸡，并不影响肉鸡前期（0～16日龄）的生长性能，这与杜恩存[8]的研究结果一致。在灌服产气荚膜梭菌期间（17～23日龄），CP组肉鸡的平均日增重显著降低，而饲粮中添加复合植物活性成分显著增加了产气荚膜梭菌感染肉鸡的平均日增重，表明复合植物活性成分具有缓解肉鸡生长性能降低的效果。Sun等[9]研究报道，在感染产气荚膜梭菌肉鸡饲粮中添加百里香酚和香芹酚为主要成分的复合物能提高生长后期体重。本试验结果表明在肉鸡感染产气荚膜梭菌后（24～30日龄），饲粮中添加复合植物活性成分有增加平均日增重和降低平均日采食量的趋势，说明饲粮中添加复合植物活性成分不会影响生长性能，并在一定程度上具有改善产气荚膜梭菌感染肉鸡生长性能的作用。

3.2 复合植物活性成分对产气荚膜梭菌感染肉鸡肠道组织形态的影响

肠道的正常发育是肉鸡饲粮消化吸收的基础，也是反映肠道健康状况的指标之一。当外源性与内源性病毒入侵时，良好的肠道发育能起到一定的物理防护作用。肠道绒毛高度、隐窝深度及其二者比值是衡量肠道机械屏障的重要指标[10]。小肠绒毛高度提高和隐窝变浅可表明消化吸收能力增强，生长性能提高。严霞等[11]在饲粮中添加复合植物精油与微生态制剂组合显著提高了竹丝鸡十二指肠和回肠的绒毛高度，促进了肠道发育。燕磊等[12]研究发现，香芹酚和百里香酚混合植物精油显著降低了肉鸡十二指肠隐窝深度，同时提高十二指肠V/C值。本试验结果表明，产气荚膜梭菌感染使23日龄肉鸡回肠V/C的比值降低，与Liu等[13]研究结果一致。添加复合植物活性成分促进了23日龄感染肉鸡十二指肠和回肠肠道形态的发育，降低了感染肉鸡回肠隐窝深度，表明其对肠黏膜有改善作用。在感染条件下，添加复合植物活性成分对30日龄肉鸡空肠绒毛高度有益，同时提高了空肠V/C值。Pei等[14]研究表明，含有肉桂醛的精油有一定的抑菌作用，且与丁香酚组合有协同作用，这与本试验研究结果类似。表明复合植物活性成分能促进肠绒毛的发育，增强肠道吸收能力，缓解肠道损伤，对肠道健康具有一定的改善作用。

3.3 复合植物活性成分对产气荚膜梭菌感染肉鸡肠道屏障相关基因表达的影响

完整健康的肠道通过肠道屏障功能来抵御外来病原的入侵，其功能主要分为机械、化学、微生物和免疫等方面，是机体最重要的一道屏障[15]。肠道黏膜上皮细胞、细胞间紧密连接和黏液层三部分构成了肠道的机械屏障。肠道上皮细胞间的紧密连接可阻止大分子物质跨过肠道上皮细胞，对维持肠道屏障具有重要作用[16]。调控肠道上皮的屏障功能中重要的紧密连接蛋白包括是Claudin家族、Occludin和E-cadherin等。Claudin-1的功能是形成屏障，对维持肠黏膜离子通透性起着重要作用。Claudin-2是一种成孔紧密连接蛋白，其含量增加表示肠道通透性增强。杜恩存[8]在日粮中添加120 mg/kg以百里香酚和香芹酚为活性成分的植物精油提高了肉鸡Claudin-1的相对表达量。本试验结果与上述结果基本一致，添加复合植物活性成分上调了23日龄肉鸡空肠Claudin-1的相对表达量，但下调了感染组23日龄空肠Claudin-2的相对表达量。

Occludin在维持细胞极性中具有重要地位，也有学者认为其在紧密连接屏障功能中发挥重要作用[17]。产气荚膜梭菌对肠道屏障造成损伤时，肠黏膜的渗透性会发生改变，增加肠道的通透性[18]。Stefanello等[19]研究表明，产气荚膜梭菌感染能下调肉鸡Occludin的相对表达量，饲粮中添加精油和有机酸复合物上调了Occludin相对表达量。本试验结果显示，产气荚膜梭菌感染下调了肉鸡空肠和回肠Occludin的相对表达量，但添加复合植物活性成分上调了肉鸡空肠和回肠Occludin的相对表达量，表明复合植物活性成分的能调控肠道Occludin表达，缓解产气荚膜梭菌诱导的肠黏膜屏障损伤。

E-cadherin在上皮细胞的形态形成和维持过程中扮演重要角色[20]，其表达通过能量代谢促进细胞增殖[21]。本试验中产气荚膜梭菌感染显著下调了肉鸡空肠和回肠E-cadherin的相对表达量，添加复合植物活性成分上调了感染组空肠E-cadherin的相对表达量且达到了与对照组相同的水平，表明产气荚膜梭菌感染破坏了肠道健康，添加复合植物活性成分能起到一定的缓解作用。

覆盖在肠上皮细胞上的黏液外层和外层组成了肠道的化学屏障，能阻止病原菌的入侵[22]。黏液是由肠道杯状细胞分泌的，其中分泌型的凝胶黏液包括Mu⁃cin-2和Mucin5ac等[23]。Mucin-2能编码分泌黏蛋白，可通过提高蛋白亲水性，对肠黏膜起到一定的润滑作用，保护肠上皮细胞，增强屏障功能[24]。有研究显示Mucin-2的表达会受到一些植物成分的影响。在肉仔鸡日粮中添加肉桂、百里香和姜黄提取物能增加小肠mucin-2基因表达和防御能力[25]。本试验结果显示，复方植物活性成分上调了空肠Mucin-2和Mucin5ac的相对表达量。产气荚膜梭菌感染及复合植物活性成分的添加均对回肠Mucin-2的表达没有显著影响，但饲粮中添加复合植物活性成分上调了感染肉鸡Mucin-2的相对表达量。TFF是与黏液结合的肽类物质，能维持肠黏膜的完整性[22]，TFF-2能够促进黏液蛋白形成凝胶，从而防止病原物质的侵入。本试验结果显示，感染产气荚膜梭菌下调了空肠和回肠TFF-2的相对表达量，但添加复合植物活性成分上调了感染肉鸡回肠TFF-2的相对表达量。表明复合植物精油能增加黏液的分泌，有助于阻止产气荚膜梭菌的入侵。

4 结论

饲粮中添加400 mg/kg复合植物活性成分能改善产气荚膜梭菌感染肉鸡生长性能和肠道形态结构，调控肠道屏障功能相关基因表达，缓解肉鸡肠道损伤。