添加山豆根多糖对吉富罗非鱼生长性能及生理生化指标的影响

2021-11-18刘梦倩文露婷杜雪松覃俊奇胡庭俊

饲料工业 2021年20期

■刘梦倩文露婷，李旻赵怡杜雪松覃俊奇胡庭俊林勇*

（1.广西大学动物科学技术学院，广西南宁 530005；2.广西壮族自治区水产科学研究院，广西南宁 530021）

吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus,GIFT strain）是尼罗罗非鱼经遗传改良而选育得到的罗非鱼新品系，因其生长速度快、个体大、出肉率高和易捕捞等优点成为了我国罗非鱼（Tilapia）养殖的主导品种[1-4]。但随着罗非鱼的大规模高密度养殖和抗生素类药物在水产饲料添加剂中的禁用，罗非鱼链球菌等细菌病、肝胆综合征等代谢性疾病的频繁暴发给养殖户造成了严重的经济损失[5]。因此开发一种安全高效，且能够增加鱼体自身免疫能力的饲料添加剂成为了近年来的研究热点[6-7]。中药活性成分提取物因具有安全、有效、低毒等特点被广泛应用在饲料添加剂中[8-9]。山豆根（Sophora tonki⁃nensis），又名广山豆根，是豆科槐属植物越南槐的干燥根及根茎，是一种具有抗炎、抗菌、调节免疫、抗氧化等药理活性的广西道地中药材[10-11]。山豆根多糖（Sopho⁃ra subprostratepolysaccharide,SSP）是从山豆根中提取、分离、纯化得到的总多糖[12-13]。相比于山豆根生物碱而言，山豆根多糖在动物机体上的使用更加安全且同时兼备免疫调节、抗氧化、抗病毒等药理活性[14-16]。帅学宏等[17]将不同浓度的山豆根多糖（SSP）注射到免疫抑制模型小鼠腹腔后，发现SSP通过提高免疫抑制小鼠的脾脏指数、胸腺中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性和还原型谷胱甘肽（GSH）水平，增加小鼠胸腺清除羟自由基的能力，说明SSP通过调节机体内自由基相关酶的活性来影响体内自由基的产生和清除能力，从而使机体免疫器官免受氧化损伤，进而发挥免疫调节功能。本实验室前期开展了山豆根多糖不同添加量对罗非鱼的生长性能、免疫与抗菌性能等影响的研究，得出2 g/kg的山豆根多糖添加量对罗非鱼具有较为理想的促生长和提高免疫力的效果。结合前期研究的初步结果，现扩大罗非鱼的试验样本量，以2 g/kg的山豆根多糖为最佳的推荐剂量对罗非鱼进行为期30 d的养殖投喂试验，通过测定罗非鱼生长性能及免疫相关指标，探讨2 g/kg的山豆根多糖作为饲料添加剂在罗非鱼养殖实践中的应用效果，为开发新型饲料添加剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 药物及试剂

山豆根多糖，由广西大学动物科学技术学院药理实验室分离提取，为白色粉末，易溶于水，在乙醇中几乎不溶；与碱性酒石酸铜反应呈棕红色沉淀；单糖含量为9.36%；干燥失重为3.25%；重金属<10 mg/kg；蛋白质检测未见浑浊；多糖含量为83.58%；黄芪多糖（APS），购于艾迪森（北京）生物科技有限公司；基础饲料为罗非鱼膨化配合饲料，购于通威股份有限公司（营养成分：粗蛋白≥28.0%、粗脂肪≥3.0%、粗纤维≤10.0%、粗灰分≤13%、赖氨酸≥1.3%、钙0.5%～2.5%、总磷0.6%～2.0%、氯化钠0.3%～1.5%、水分≤12.0%）。按投料量0.2%的质量百分比（即2 g/kg）称取山豆根多糖，按20 mg/kg称取相应的黄芪多糖，用灭菌ddH2O分别溶解后均匀喷洒于各试验组饲料表面，辅以水产饲料黏合剂（主要成分为淀粉）混匀，39℃烘干；一氧化氮（NO）、总抗氧化能力（T-AOC）和多种酶活性检测试剂盒均购于南京建成生物工程技术研究所；免疫球蛋白（IgG）、白细胞介素12（IL-12）和γ-干扰素（IFN-γ）检测试剂盒均购自将来实业（上海）股份有限公司。

1.2 试验动物

910尾处于快速生长期吉富品系罗非鱼由广西壮族自治区水产研究院国家级罗非鱼良种场提供，体质健壮，体重为（58.00±1.69）g。采用3%食盐水对良种基地引进的罗非鱼进行体表浸泡消毒，暂养于广西水产科学研究院水族实验楼30 m3的长方体露天鱼池内，驯养7 d后随机抽取10尾鱼，剖取鱼脑组织和肝脏组织进行病菌分离培养，经检查无病菌生长后开始试验。

1.3 主要仪器

ESJ110-4B分析天平（沈阳龙腾电子有限公司）、TD5A-WS台式低速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、H1650-W台式微量高速离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）、Sysemx2100全自动血液分析仪（日本SYSMEX公司）、Hltachi7180全自动生化分析仪（日本日立诊断产品有限公司）、Rayto RT-6100全自动酶标仪（美国雷杜生命科学股份有限公司）。

1.4 动物分组及处理

将900尾吉富罗非鱼随机分为3个试验组，分别为山豆根多糖组（饲料中添加2 g/kg的山豆根多糖）、黄芪多糖对照组（饲料中添加20 mg/kg的黄芪多糖）以及空白对照组（投喂基础饲料），每组3个生物学重复，每个重复100尾罗非鱼，分别饲养于30 m3方形鱼池的9个不同的网箱内。每天按鱼体重的5%，分3次（9：00、12：00、18：00）进行投料，饲养周期为30 d。试验期间连续供氧，每天上午喂料前换水2/3，试验期间水温（27±2）℃，每天观察池内罗非鱼的活动情况。

1.5 样品采集和相关指标检测

1.5.1 生长性能指标

于试验开始前1 d和给药后第30 d，对罗非鱼停饲12 h，从每个试验组的重复池中随机抓取罗非鱼各30尾，经适量MS-222麻醉后，用电子天平对其进行体重测量（分度值为0.01 g），再经尾静脉窦采集血液，最后剖取其完整的脾脏称重并记录，另剖其肝脏取同一部位约1 g样品存于-80℃，用于后续相关酶活性的测定。按以下标准公式计算相关生长性能。

增重率（WGR，%）=[末重(g)-初重(g)]/初重(g)×100

特定生长率（SGR，%/d）=[ln末重(g)-ln初重(g)]/饲养时间(d)×100

肥满度（CF，g/cm3）=体重(g)/[体长(cm)]3×100

饲料系数（FCR）=饲料摄入量（g）/[末重(g)-初重(g)]脾脏指数（SI，%）=脾重(g)/体重(g)×100

1.5.2 血液生理、生化、抗氧化及免疫指标测定

将上述给药后第30 d进行生长性能测定的罗非鱼进行血液采集，将得到的血液样本分为两份分别进行生理和生化指标的测定。用2 mL一次性无菌注射器从罗非鱼的臀鳍侧线下方进针，抽取尾静脉血2～3 mL，每一尾鱼的血液作为一个样本分为两份：一份加入到含ETDA-K2的抗凝采血管中，4 h以内进行全血常规生理指标测定；剩余血液装于2 mL无菌EP管内，斜置，4℃冰箱内静置过夜，3 000 r/min离心10 min，分装血清，用于血液生化指标以及酸性磷酸酶（ACP）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、免疫球蛋白（IgG）、白细胞介素12（IL-12）等血清抗氧化指标和免疫指标的测定。

1.5.3 肝脏抗氧化指标测定

将采集的肝脏组织用灭菌生理盐水进行匀浆，在3 000 r/min下离心10 min，取上清液，按试剂盒说明书进行肝脏总蛋白浓度、过氧化物酶（POD）、总抗氧化能力（T-AOC）等抗氧化指标的测定。

1.6 数据分析

试验数据采用IBM SPSS Statistics V26.0软件进行单因素方差分析和LSD多重比较，数据以“平均值±标准差（Mean±SD）”表示。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。

2 结果与分析

2.1 山豆根多糖对罗非鱼生长性能的影响（见表1）

从表1可知，在初始体重一致（P>0.05）的情况下，山豆根多糖组和黄芪多糖对照组的罗非鱼终末体重显著高于空白对照组（P<0.05），并且增重率（WGR）和特定生长率（SGR）均极显著高于空白对照组（P<0.01）；3个试验组罗非鱼肥满度（CF）和饲料系数（FCR）均无显著差异（P>0.05）；黄芪多糖对照组罗非鱼的脾脏指数极显著高于山豆根多糖组和空白对照组（P<0.01）。

2.2 山豆根多糖对罗非鱼血液生理指标的影响（见表2）

表2 山豆根多糖对罗非鱼血液生理指标的影响（n=30）

如表2所示，山豆根多糖组和黄芪多糖对照组罗非鱼血液中淋巴细胞比例均极显著高于空白对照组（P<0.01）；与空白对照组和黄芪多糖对照组相比，山豆根多糖极显著降低了罗非鱼血液中中性粒细胞百分比和血红蛋白浓度（P<0.01）；其余各项血液生理指标差异不显著（P>0.05）。

2.3 山豆根多糖对罗非鱼血液生化指标的影响（见表3）

表3 山豆根多糖对罗非鱼血液生化指标的影响（n=30）

从表3可见，与黄芪多糖对照组和空白对照组相比，山豆根多糖组显著降低了罗非鱼血清中白蛋白和碱性磷酸酶的水平（P<0.05）；山豆根多糖组罗非鱼血清中谷草转氨酶活性极显著高于空白对照组（P<0.01），且显著低于黄芪多糖对照组（P<0.05）；山豆根多糖组罗非鱼血清中三酰甘油含量与空白对照组相比差异不显著（P>0.05），与黄芪多糖对照组相比极显著升高（P<0.01）；各试验组罗非鱼血清中总蛋白含量、谷丙转氨酶活性和肌酐含量差异均不显著（P>0.05）。

2.4 山豆根多糖对罗非鱼血清免疫指标的影响（见表4）

表4 山豆根多糖对罗非鱼血清免疫指标的影响（n=30）

从表4可见，黄芪多糖对照组罗非鱼血清中酸性磷酸酶（ACP）极显著低于山豆根多糖组（P<0.01），但与空白对照组差异不显著（P>0.05）；黄芪多糖对照组罗非鱼血清一氧化氮（NO）水平极显著高于山豆根多糖组（P<0.01），但两者与空白对照组差异不显著（P>0.05）；黄芪多糖对照组罗非鱼血清溶菌酶（LZM）水平显著高于山豆根多糖组（P<0.05），且极显著高于空白对照组（P<0.01）。山豆根多糖组和黄芪多糖对照组罗非鱼血清中过氧化物酶（POD）活性和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平均极显著高于空白对照组（P<0.01）；山豆根多糖血清中总抗氧化能力（T-AOC）极显著低于黄芪多糖对照组和空白对照组（P<0.01）；山豆根多糖组和黄芪多糖对照组罗非鱼血清中总超氧化物歧化酶（T-SOD）水平均极显著低于空白对照组（P<0.01）。各试验组罗非鱼血清中多酚氧化酶（PPO）活性均差异不显著（P>0.05）。

2.5 山豆根多糖对罗非鱼血清中细胞因子分泌的影响（见图1）

从图1可知，与空白对照相比，山豆根多糖极显著提高了罗非鱼血清中IFN-γ水平（P<0.01），并且极显著降低罗非鱼IL-12和IL-2水平（P<0.01）；黄芪多糖对照组罗非鱼血清中IFN-γ水平也极显著高于空白对照组。

图1 山豆根多糖对罗非鱼血清中细胞因子分泌的影响（平均值±标准差，n=30）

2.6 山豆根多糖对罗非鱼肝脏免疫功能的影响（见表5）

表5 山豆根多糖对罗非鱼肝脏免疫指标的影响（n=30）

从表5可见，山豆根多糖组与黄芪多糖对照组均能提高罗非鱼的肝脏中过氧化物酶（POD）活性和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）水平，与空白对照相比差异极显著（P<0.01），其中山豆根多糖组POD活性显著低于黄芪多糖对照组（P<0.05），而山豆根多糖组GSH-Px水平显著高于黄芪多糖对照组（P<0.05）；黄芪多糖组提高了罗非鱼肝脏中总抗氧化能力（T-AOC），与山豆根多糖组和空白对照组相比差异极显著（P<0.01）；山豆根多糖组总超氧化物歧化酶（T-SOD）显著低于黄芪多糖对照组和空白对照组（P<0.05）。

3 讨论

3.1 山豆根多糖对罗非鱼生长性能的影响

研究发现，饲料中添加黄芪多糖能显著提高卵形鲳鲹和尼罗罗非鱼的增重率和特定生长率，其促生长的效果随饲料中黄芪多糖含量表现出先升高后降低的趋势[18-19]。在本试验中，向罗非鱼饲料中分别添加2 g/kg的山豆根多糖和20 mg/kg的黄芪多糖并连续投喂30 d后，罗非鱼的增重率、特定生长率都极显著高于空白对照组，而各试验组鱼的饲料系数并无显著差异。表明山豆根多糖和黄芪多糖一样具有促进罗非鱼生长并提高饲料转化率、降低养殖成本的积极作用。许丹宁等[20]在研究白术多糖促仔猪生长的内分泌机制时发现：白术多糖可能是通过促进下丘脑-垂体-肝脏生长轴上血清生长激素（GH）、类胰岛素生长因子-1（IGF-I）的合成与分泌，提高蛋白合成，增强肌肉生长，同时促进T3、T4和cAMP的合成与分泌，加速脂肪的氧化分解。而本试验中山豆根多糖促生长的作用机制有待进一步探究。

3.2 山豆根多糖对罗非鱼血液生理生化指标的影响

血清中生化物质的相对含量反映了机体生理及营养状态[21]。黄芪多糖能降低罗非鱼的三酰甘油含量，证实了黄芪多糖具有降血脂的作用。谷丙转氨酶和谷草转氨酶在机体的蛋白代谢中发挥着重要的作用，两者在体内的活性是反映肝功能的重要指标，两者在血清中含量上升提示肝细胞受损，而下降则标志着疾病的康复[22]。在本试验中，山豆根多糖和黄芪多糖对照组罗非鱼血清中谷草转氨酶的活性均明显提高，而山豆根多糖组罗非鱼血清谷草转氨酶活性又低于黄芪多糖对照组。并且山豆根多糖组罗非鱼血清中白蛋白和碱性磷酸酶显著低于黄芪多糖组。表明两者添加到饲料中长期投喂可能对罗非鱼肝脏有一定的损伤，其具体的脏器损伤程度有待做下一步病理学分析。这一结果与谭连杰[18]和孙爱杰等[23]在研究当归多糖、枸杞多糖和黄芪多糖对卵形鲳鲹血液生化指标的结果一致，体现了单纯的植物多糖在生物活性调节作用上的双向性。

3.3 山豆根多糖对罗非鱼免疫功能的影响

免疫细胞是参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞。淋巴细胞是动物机体的淋巴器官产生的一类白细胞，作为鱼类体内含量最多的白细胞，鱼类的淋巴细胞参与了机体自身的特异性免疫反应，在机体免疫应答过程中发挥着关键作用。因此，淋巴细胞在血液中的相对含量和活性可以反映出机体的免疫水平[24]。研究表明，香菇多糖、灵芝多糖、枸杞多糖等均可有效提高鱼类的免疫细胞活性[25]。与上述研究结果相似，本试验中山豆根多糖组和黄芪多糖对照组均能显著促进罗非鱼血液中淋巴细胞的增殖，提高罗非鱼血液中淋巴细胞的比率，进而增强罗非鱼的免疫力。

在本试验中黄芪多糖的抗氧化活性是通过降低罗非鱼血清中酸性磷酸酶活性并且同时提高溶菌酶、过氧化物酶、谷胱甘肽过氧化物酶和总抗氧化能力活性来实现的。而山豆根多糖则通过提高罗非鱼血清和肝脏中过氧化物酶和谷胱甘肽过氧化物酶活性，同时降低血清和肝脏的总抗氧化能力和总超氧化物歧化酶的活性来增强机体清除氧自由基的能力，以此确保体内氧化和抗氧化反应的动态平衡。