藏猪和约克夏猪PGM1 基因多态性和表达差异研究

赵雨农，李 盼，段梦琪，商 鹏，张 博

（1.中国农业大学畜禽育种国家工程实验室/高原畜禽遗传资源研究中心，北京 100193；2.西藏农牧学院动物科学学院，西藏林芝 860000）

我国是猪肉生产与消费大国，目前猪肉市场大多被瘦肉型三元杂交猪占据[1-2]。此类猪种具有生长速度快、瘦肉率高的特点，但其肉品质远不如我国许多地方猪种，比如民猪、金华猪、藏猪等[3-5]。近年来，我国对畜禽种业越来越重视，对本土种质资源的普查、保存、开发及利用已是当前遗传育种的重要任务之一。藏猪是我国特有的小型高原猪种，具有生长速度慢、肉质风味佳的特点，深受广大民众喜爱[6-7]，但其出栏周期长、养殖成本高，通过分子育种技术对藏猪生长发育相关性状开展研究是推动本地品种更好地进入市场、最终实现产业化的重要手段。

PGM1（Phosphoglucomutase1）是一个有效的磷酸葡萄糖变位酶，广泛存在于动植物和微生物体内。猪PGM1基因位于6 号染色体长臂末端，与多个肌肉生长或肉品质相关基因位于同一区域[8-11]。PGM1基因在猪组织中广泛表达，其中骨骼肌中的表达最丰富[12]，该基因缺乏可能直接影响糖原代谢、糖酵解和蛋白质糖基化。PGM1基因与肌肉形成过程有密切联系，能够影响肌肉发育[13]。

本研究选择中国地方猪种藏猪和引进猪种约克夏猪为研究对象，采用Sanger 测序对PGM1基因5'端上游3 000 bp 的单核苷酸多态性位点进行筛选，通过荧光定量检测藏猪和约克夏猪的肝脏、背最长肌、背脂组织中PGM1基因mRNA 水平表达量，分析PGM1基因对藏猪生长发育的调控功能，为藏猪资源保护和品种选育提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物 本研究选择饲养在西藏农牧学院教学实习牧场的180 日龄大小体重相近、性别均为公猪、饲喂方式相同、健康状况良好的藏猪（TP）和约克夏猪（YY）各6 头，屠宰采集肝脏、背最长肌、背脂等组织，液氮速冻，-80℃保存，用于总RNA 提取。另外，采集80份耳组织（藏猪40 头，约克夏猪40 头），放入75%酒精中，-20℃保存，用于基因组DNA 提取。

1.2 DNA、RNA 提取与cDNA 合成 采用苯酚/ 氯仿抽提法从耳组织中提取基因组DNA[14]，用1% 琼脂糖凝胶电泳和Nano Drop 2000 分光光度计检测DNA 质量和浓度，RNase-Free ddH2O 溶解，-20℃保存。

利用RNA 提取试剂盒（康为世纪生物科技有限公司，CW0584S）提取实验猪背最长肌、背脂和肝脏组织的总RNA。用Nano Drop 2000 分光光度计检测RNA 质量和浓度，-80℃保存。

采用cDNA Synthesis SuperMix 试剂盒（北京天根生化科技有限公司，KR180123）进行反转录，-20℃保存备用。

1.3 SNPs 筛选与转录因子预测

1.3.1 引物设计与合成 从NCBI 网站下载PGM1基因组序列（登录号：NC_010448.4），使用Primer Premier 5.0 软件设计5'侧翼区3 000 bp 序列的特异性引物（表1）。由北京六合华大基因科技有限公司合成，RNase-Free ddH2O 溶解，4℃保存。

1.3.2 SNPs 筛选 利用验证成功的特异性引物对藏猪和约克夏猪分别进行特异性片段扩增，每个品种准备10 个个体，将扩增产物进行混池，并由生工生物工程（上海）股份有限公司进行测序。利用Chromas Pro

2.1.3 软件对测序结果进行分析，筛选SNPs 位点。利用PCR-RFLP 法扩大检测个体数量，统计分析基因型和基因频率。使用限制性内切酶Kpnl（GGTAC^C）进行酶切，酶切体系总体积为20 μL：Kpnl 1 μL，PCR 产物3.5 μL，NEB buffer 2 μL，ddH2O 13.5 μL，37℃酶切过夜。藏猪和约克夏猪各做40 个个体酶切。

1.4 实时荧光定量PCR

1.4.1 实时荧光定量PCR 定量引物 本实验以RNF7基因为内参基因，RNF7和PGM1基因引物序列分别来自Wang 等[15]、于江宇等[16]（表2），由北京华大基因科技有限公司合成，RNase-Free ddH2O 溶解，4℃保存。

表2 猪RNF7、PGM1 基因RNA 引物序列

1.4.2 实时荧光定量PCR 以cDNA 为模板，每个个体设置3 个生物学重复，选择SYBR Green Mix 定量PCR试剂盒（北京天根生化科技有限公司，FP171206）对PGM1基因进行实时荧光定量PCR。采用2-ΔΔCt方法计算基因的mRNA 表达水平。

样品目的基因的表达量采用2-ΔΔCt法计算：

ΔCt（样品）=Ct（样品目的基因）–Ct（样品内参基因）

ΔCt（标准样）=Ct（标准样目的基因）–Ct（标准样内参基因）

ΔΔCt=ΔCt（样品)–ΔCt（标准样）

目的基因表达量=2-ΔΔCt

1.5 统计分析 利用χ2检验分析基因型分布和基因型频率差异。利用SPSS 18.0 软件进行单因素方差分析，数据以“平均值±标准误”表示，SigmaPlot 10.0 软件作图，P<0.05 表示差异显著，P<0.01 表示差异极显著，P>0.05 无显著性差异。

2 结果与分析

2.1 基因型频率和等位基因频率分布 通过Sanger 测序发现藏猪PGM1基因在5' 侧翼区1 636 bp 处有1 个多态性位点，记为A-1636G（图1）。利用PCR-RFLP法分别将藏猪和约克夏猪各40 个个体产物进行酶切，共计产生3 种基因型即AA、AG、GG（图2）。当酶切的2 条片段长度分别为840 bp 和165 bp 时，该基因型记为AA 型；当酶切片段切成2 个片段，长度分别为1 005 bp 和840 bp 时，该基因型记为杂合型AG 型；当酶切片段切成一个片段，长度为1 005 bp，该基因型记为GG 型。

图1 A-1636G 突变测序峰图

图2 PGM1 基因酶切检测结果

根据酶切结果计算基因型频率和基因频率，结果见表3。由表3 可知，约克夏猪PGM1基因酶切位点优势基因型为AA；而藏猪的优势基因型为GG，约克夏猪的A 基因频率明显高于藏猪。经卡方检验发现，该酶切位点在藏猪及约克夏猪中均符合哈迪-温伯格平衡定律，在2 个品种间呈极显著差异。

表3 PGM1 基因PCR-RFLP 基因型频率及卡方检验

2.2PGM1基因mRNA 表达PGM1基因在藏猪肝脏中表达量极显著高于约克夏猪，在藏猪背最长肌中表达量显著高于约克夏猪，在藏猪背脂中表达量极显著低于约克夏猪（图3）。

图3 PGM1 基因在肝脏、背最长肌和背脂组织中的表达量

3 讨 论

藏猪产业是我国西藏地区农牧产业的重要组成部分，如何进一步开发利用藏猪这一重要种质资源对西藏自治区的发展有积极作用。藏猪的生长周期及脂肪的过度沉积直接影响了藏猪产业的经济效益。PGM1是肌糖原分解代谢的关键酶，与肌肉生长发育、脂肪沉积有着密切联系[17]。Shang 等[18]通过组学数据的筛选及分析鉴定了PGM1基因在表达量高时对猪骨骼肌的生长发育具有抑制作用。

本研究通过对PGM1基因进行SNPs 位点筛选分析发现，于5'侧翼区存在A-1636G 这一突变位点，符合哈迪-温伯格平衡定律，且引进瘦肉型猪种约克夏猪的生长速度快、瘦肉率高；藏猪生长速度慢，瘦肉率偏低。藏猪和约克夏猪品种间该位点基因型频率分布存在极显著差异，由此初步判断该SNP 位点AA 型为不利于脂肪沉积、生长速度快的基因型，GG 型为有利于脂肪沉积、生长速度慢的基因型。进一步在mRNA 水平研究发现，在背最长肌组织中，约克夏猪mRNA 表达量显著低于藏猪；然而在脂肪组织中，约克夏猪mRNA 表达量极显著高于藏猪，结果表明PGM1基因是增加肌内脂肪（IMF）含量的有效基因。李庆岗[19]在对姜曲海瘦肉型猪早期发育规律研究中发现，肌肉中肌糖原的储存数量随着生长发育高峰期的到来而升高。当机体内肌糖原过度消耗后，肝脏组织通过分解肝糖原补充血糖以维持机体稳态，因此PGM1基因在肝脏和背最长肌组织中的表达趋势一致符合机体发育机理，也由此推测PGM1基因在猪肝脏、背最长肌组织中的高表达可能是通过促进肌糖原的代谢而抑制了生长发育，这与藏猪较约克夏猪生长速度慢、体长较短的生理特性相符。Meng 等[20]和Kim 等[21]分别通过对牛和猪的脂肪沉积、屠宰性能测定等方面进行研究发现，PGM1基因与脂肪生成、猪肉肉质品质等均有一定相关性。糖原的过度积累会导致其转化为脂肪进行储能，因此，在背脂组织中，该基因的表达量表现为约克夏猪极显著高于藏猪，即约克夏猪脂肪组织中该基因表达量较高，能够进一步促进肌糖原的消耗，抑制脂肪沉积，这与约克夏猪为瘦肉型、藏猪为脂肪型猪种相符合。联合SNPs 位点分析及RTqPCR 结果发现，藏猪和约克夏猪的差异性在两个实验中趋于一致，推测可能该突变位点与调控猪肌肉生长、脂肪沉积性状密切相关，本研究对后续开展大群体藏猪选育工作提供了重要分子依据。

4 结 论

本实验通过对PGM1基因DNA 和mRNA 水平研究发现，该基因5'侧翼区存在1 个多态性位点A-1636G，其多态性与mRNA 表达差异性相关，即此位点可能是影响猪肌肉生长发育和脂肪沉积的功能位点，推测PGM1基因参与调控猪的肌肉生长发育，起到负调控作用，该结论为进一步探究猪生长发育的具体调控机制提供重要依据。