烟酰胺核糖抵抗高脂饮食诱导心肌损伤的机制研究

郭艳杰,文 和,卫锦娟,王 莹,倪四峰,马 炜,王长鹰,陈 宁(西安国际医学中心医院心内科,西安 70075;空军军医大学航空航天医学系;空军军医大学唐都医院心内科;西北农林科技大学医院;通讯作者,E-mail:0605@qq.com)

据国际糖尿病联盟(IDF)报道,预计到2040年,全球肥胖人数将超过5亿,2型糖尿病患者人数将超过6.42亿[1]。肥胖与2型糖尿病常常前后发生,并伴随有高脂血症和胰岛素敏感性降低[2]。诸多研究[3,4]表明,肥胖、2型糖尿病的出现将严重危害心血管健康,二者会导致心脏出现代谢紊乱、脂质堆积、氧化应激损伤加剧等诸多不良改变,最终损害心脏功能,严重时将导致心衰的发生。来自欧洲的一项统计数据表明,超过80%的心衰患者为肥胖人群[5]。

脂肪酸是心脏能量供给的重要来源,正常心肌组织70%-90%的能量来自脂肪酸的β氧化。由于肥胖人群常常存在高脂血症并伴随胰岛素敏感性降低,心肌组织对糖的利用率进一步降低,对脂肪酸的吸收利用进一步增加[6]。同时,肥胖患者常常存在心肌线粒体功能损伤,导致大量脂肪酸无法在心肌组织中被完全氧化利用[7]。大量的脂肪酸及其中间代谢产物(二酰基甘油、游离脂肪酸、神经酰胺等)在心肌组织堆积,干扰心肌组织生物信号的正常传递,过量蓄积的过氧化脂质还将极大加重心肌组织的氧化应激损伤[8]。因此,有效地促进心肌组织脂质的完全代谢,减少脂质及其中间代谢产物的堆积,是抵抗肥胖诱导的心肌损伤的重要途径。

烟酰胺核糖(nicotinamide riboside, NR)是一类存在于牛奶中的小分子物质,属B族维生素衍生物。既往研究表明,烟酰胺核糖具有抗氧化、抗衰老、心血管保护等治疗效果[9]。发表在CellMetabolism的一项研究意外发现,NR能够抵抗高脂饮食诱导的肥胖[10],提示NR可能与脂质代谢存在密切联系,但是该研究未对NR是否能够促进心肌脂代谢及其具体机制作深入探讨,本研究通过建立肥胖动物模型及高脂细胞模型,并给予外源性NR干预,观察NR对于心脏功能、心肌组织脂质代谢的影响,并探寻其具体机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级野生型C57BL小鼠24只,鼠龄8周龄,体质量20-25 g,购自常州卡文斯模式动物中心。

1.1.2 试剂 高脂饲料购自美国Research Diet公司;烟酰胺核糖购自美国Sigma公司;神经酰胺含量测试盒购自碧云天生物公司;游离脂肪酸含量测试盒购自美国默克公司;过氧化脂质含量测试盒购自美国默克公司;线粒体绿色荧光探针购自美国Thermo公司;脂肪酸红色荧光探针购自美国Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 肥胖小鼠模型的建立 24只8周龄雄性小鼠随机分为3组:正常饮食组(Con组)、高脂饮食组(HFD组)、高脂饮食+烟酰胺核糖组(HFD+NR组),每组8只。高脂饮食组给予高脂饮食喂养4个月以诱导肥胖小鼠模型。高脂饮食+烟酰胺核糖组给予高脂喂养4个月,在高脂喂养的第3月初开始同时给予800 mg/kg的NR溶于生理盐水中灌胃,持续灌胃2个月。

1.2.2 超声心动图检测小鼠心脏功能 使用高分辨率超声仪检测小鼠心脏功能;以异氟烷麻醉小鼠,将小鼠固定在恒温垫上。获取胸骨旁长轴切面的M型超声心动图,软件自动测算左心室射血分数以及左心室短轴缩短率。

1.2.3 心肌组织油红O染色 将取下的心脏标本置于4%的多聚甲醛溶液中,冰冻条件下切片。按照油红O染色试剂盒(西安中晖赫彩生物)说明书制备油红O染色工作液并进行染色,染色完成后光镜下观察并拍照。

1.2.4 原代心肌细胞的提取和培养 选择1-3日龄的SD大鼠乳鼠,放入75%酒精溶液充分浸泡消毒,取出心脏,放置于PBS中充分清洗,剪碎,加入Ⅰ型胶原酶消化30 min,取消化液离心重悬铺板。将细胞分为正常培养组(Con组),高脂培养组(Pal组)和高脂培养+烟酰胺核糖组(Pal+NR组)。Con组给予含25 mmol/L葡萄糖+10% FBS的培养基培养24 h;Pal组在Con组基础上同时给予500 μmol/L的棕榈酸培养24 h;Pal+NR组在Pal组基础上同时加入2 mmol/L的烟酰胺核糖培养24 h。

1.2.5 心肌组织神经酰胺、游离脂肪酸、二酰基甘油含量的检测 取新鲜心肌组织,充分研磨,离心后取上清。使用美国BD公司的神经酰胺含量测试盒、游离脂肪酸含量测试盒和二酰基甘油含量检测试剂盒,所有操作均按照试剂盒说明书严格执行,规范操作后上机,酶标仪分析获得数据。

1.2.6 Seahorse检测心肌细胞脂肪酸β-氧化效率 提前将原代心肌细胞种植于特制的细胞培养板中(V7-PS,安捷伦公司),并给予高脂或NR处理24 h。检测当天,将培养基更换为Seahorse检测液,置入37 ℃孵箱稳定1 h。依次加入寡霉素、FCCP和抗霉素,由Seahorse检测仪通过检测探头分别检测细胞基础氧耗值,ATP生成相关的氧耗值和最大氧耗值。依托莫西(Etomoxir)为脂肪酸β氧化的抑制剂,对照组加入依托莫西后降低的差值即为脂肪酸依赖的线粒体氧耗率。

1.2.7 线粒体、脂肪酸的染色 按照说明书操作步骤制备线粒体探针染色工作液(Mito-tracker green, thermo公司),直接向细胞培养基中加入2 μl/ml的线粒体染色工作液进行染色,放入孵箱中避光孵育30 min,即可在共聚焦显微镜下观察拍照。脂肪酸染色需提前16 h向培养基中加入0.2 μl/ml的Bodipy 558/568 C12工作液(thermo公司,美国),培养16 h后即可在激光共聚焦显微镜下观察。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 烟酰胺核糖对高脂饮食喂养的小鼠心脏功能的影响

相比于正常喂养小鼠,高脂饮食喂养小鼠4个月后,小鼠心脏功能出现显著损伤,表现在高脂饮食组小鼠左心室射血分数显著低于正常饮食组(P<0.05);左心室短轴缩短率显著低于正常饮食组(P<0.05)。相比于单纯高脂饮食组,烟酰胺核糖治疗组的小鼠心脏功能出现了显著的改善,左心室射血分数显著升高(P<0.05)左心室短轴缩短率显著升高(P<0.05,见图1)。

2.2 烟酰胺核糖对高脂饮食喂养小鼠体质量及心脏脂质含量的影响

相比于正常喂养组,高脂饮食组喂养小鼠4个月后,小鼠体质量显著升高(P<0.05);相比于单纯高脂饮食组,烟酰胺核糖治疗组小鼠体质量显著下降(P<0.05)。油红O染色显示,相比于正常饮食组,高脂饮食组小鼠心肌组织出现了大量脂质堆积(见图2,左上脂质染色呈现棕红色点状,棕红色深者脂质堆积更加显著)。此外,相比于正常饮食组,高脂饮食组小鼠心肌组织的神经酰胺含量、游离脂肪酸含量以及过氧化脂质含量也显著增多(P<0.05)。相比于单纯高脂组,烟酰胺核糖治疗组小鼠心肌组织的脂滴含量、神经酰胺含量、游离脂肪酸含量以及过氧化脂质含量都出现了显著降低(P<0.05)。

2.3 烟酰胺核糖对原代心肌细胞脂肪酸氧化效率的影响

Seahorse检测脂肪酸-线粒体荧光共染结果显示,相比于高脂处理组,烟酰胺核糖+高脂处理组脂代谢相关的基础氧耗率和最大氧耗率均出现了显著升高(P<0.05,见图3),表明烟酰胺核糖能够显著增加原代心肌细胞的脂肪酸氧化代谢效率。

2.4 烟酰胺核糖对原代心肌细胞脂肪酸分布的影响

线粒体脂肪酸共染结果显示,正常培养组原代心肌细胞中,脂肪酸与线粒体能够基本重合(92.1%±3.3%),表明绝大部分脂肪酸进入线粒体进行β-氧化。高脂处理细胞后,大部分脂肪酸聚集于细胞其他部分,未进入线粒体氧化,脂肪酸与线粒体的重合率出现了显著下降(34.2%±4.2%)。在给予外源性NR后,脂肪酸重新进入线粒体,脂肪酸与线粒体的重合率出现了显著改善(58.4%±8.1%),表明烟酰胺核糖可能通过促进脂肪酸进入线粒体β-氧化加速脂肪酸氧化效率,从而改善心肌组织脂质堆积。

3 讨论

发表在柳叶刀杂志的最新研究结果表明,中国成年人中已经有超过一半的人群存在超重或肥胖[11]。肥胖、高脂血症和脂代谢异常与心血管疾病的发生密切相关。脂质是心肌组织的主要能量来源,正常情况下,心肌组织大约70%-90%的能量供给依赖于脂肪酸的β-氧化。由于肥胖患者往往伴发胰岛素抵抗症状,导致心肌组织对糖的利用进一步减少,对脂肪酸的依赖程度进一步增加。线粒体是心肌细胞的能量功能,也是脂肪酸进行β-氧化的唯一场所。大量研究指出,肥胖、2型糖尿病患者心肌组织往往存在大量的脂质堆积,表现为脂滴增多和游离脂肪酸含量增多[12,13],本研究也证实了在高脂喂养小鼠心肌组织中,心肌组织的脂滴、游离脂肪酸、神经酰胺以及过氧化脂质显著增多。神经酰胺是细胞内重要的信号分子,在细胞内承担第二信使的重要角色,心肌组织神经酰胺的异常增多将严重扰乱心肌细胞中正常的生物信号传递,危害心肌细胞功能[14]。过氧化脂质是脂肪酸被氧化后的产物,是细胞内氧化应激损伤的标志物和重要来源,心肌细胞中过氧化脂质的增多将大大加重心肌细胞的氧化应激损伤,造成细胞凋亡,最终造成心脏功能损伤。本研究结果也证实,高脂饮食能够直接诱导心脏功能损伤。如何有效地将脂肪酸转移进入线粒体使之完全氧化分解为无害的终末产物,是解决心肌组织脂毒性的重要途径。

图4 烟酰胺核糖对原代心肌细胞脂肪酸分布的影响 (n=6-8)Figure 4 Effect of NR on fatty acid distribution in cardiomyocytes (n=6-8)

既往研究[10]提示,烟酰胺核糖可能与脂肪酸代谢存在一定的关联,即烟酰胺核糖可能有一定的减肥效果。本实验研究结果也表明,对于高脂饮食诱导的肥胖,外源性给予烟酰胺核糖具有显著抑制体质量增加的效果,但其具体内在机制有待进一步研究。具体到心肌组织,本研究表明,外源性烟酰胺核糖能够显著减少心肌组织中的脂质及其中间代谢产物的堆积。心脏超声功能检测进一步证实了外源性烟酰胺核糖对于心脏功能的保护作用。正常情况下,细胞中的脂质大部分进入线粒体中进行氧化分解。然而2019年发表在DevelopmentalCell杂志的研究表明,当细胞内部无法消耗过多的脂质时,细胞会通过出泡的方式将多余的脂质排出细胞[15]。为了明确烟酰胺核糖是通过促进脂质的氧化还是促进脂质的排出,我们首先对线粒体的脂肪酸代谢效率进行了检测,结果表明,烟酰胺核糖能够显著提高线粒体的脂肪酸代谢效率。进一步用两种不同探针的检测结果表明,烟酰胺核糖能够直接促进脂肪酸进入线粒体,为脂肪酸的完全氧化创造条件。烟酰胺核糖已经不止一次出现在人们的视野中。既往认为,烟酰胺核糖在细胞内转化为NAD+,并进一步以SIRT家族依赖性的方式发挥作用[16,17]。本研究首次在动物和细胞层面指出,烟酰胺核糖能够显著改善高脂诱导的心肌损伤,并进一步指出烟酰胺核糖能够直接促进脂肪酸进入线粒体进而促进脂肪酸的β-氧化,从而抵抗高脂喂养引起的心脏脂质堆积。烟酰胺核糖这一作用的具体机制尚未完全阐释,针对此问题本课题正在作进一步深入研究。

综上,本研究首次证实,外源性给予NR能够促进心肌细胞脂肪酸进入线粒体氧化代谢,从而减少高脂诱导的心肌组织脂质堆积,最终抵抗高脂饮食诱导的心脏功能损伤。本研究对于临床肥胖患者心脏功能损伤的药物治疗具有一定的启发意义。