高效液相色谱-串联质谱法测定不同产地三叶青主要化学成分

孙崇鲁，俞松林，杨颖欣，陈宏降，张煜炯

(浙江医药高等专科学校，浙江 宁波 315100)

三叶青(TetrastigmahemsleyanumDiels et Gilg)为葡萄科崖爬藤属植物，学名三叶崖爬藤，又名角乌蔹莓、石老鼠、金钱吊葫芦等，是中国特有珍稀植物，主要分布于我国安徽、云南、福建、浙江、江西、湖南等地，2018年入选新“浙八味”中药材培育品种，具有清热解毒、消肿散结等作用，民间常用于小儿高热惊厥、咽痛、肝炎、痛疮、毒蛇咬伤、风湿性关节炎及病毒性脑膜炎等多种疾病的治疗[1]。现代药理实验研究发现三叶青块根提取物具有抗肿瘤[2]、抗病毒[3]、抗炎[4]、保肝护肝[5]、免疫调节[6]等作用。同时三叶青也是多种中成药(如华佗风痛宝、结石康胶囊、金丝地甲胶囊、金芪片等)以及保健品的主要原料。近年来三叶青野生资源因过度开发而濒临灭绝，被列入“浙江省首批种质资源保护名录”[7]。

目前药材市场上三叶青主要来源于人工栽培，主产于浙江、福建、云南、贵州等地，受气候、土壤等条件的影响，不同产地三叶青药材形态、质量差异较大。质量优劣评价标准的缺乏已经严重制约了三叶青药材产业的发展。高效液相色谱-串联质谱技术是一种新型的药物成分分析方法，根据化合物分子量的不同，采用多重离子对监测(MRM)技术进行快速分析，具有抗干扰强、灵敏度高的特点[8]。近年来该技术在分析化学领域尤其在中药研究领域得到日益广泛的应用。本实验采用高效液相色谱-串联质谱技术对不同产地三叶青的10种主要成分进行同时定量研究，为三叶青的质量控制提供了科学依据。

1 仪器与试剂

QTRAP 4500 串联四极杆质谱系统(AB Sciex公司)；LC-20AD高效液相色谱仪(日本岛津公司)；KQ-800KDB型高功率数控超声仪(昆山市超声仪器有限公司)；Secura225D-1CN电子分析天平(德国赛多利斯公司)；Sorvall ST16R型高速冷冻离心机(德国Thermo公司)；DHG-9070A型电热鼓风干燥箱(宁波江南仪器厂)；甲醇、乙腈(德国Merck公司)，色谱纯；甲酸(美国Fisher公司)，色谱纯。

山柰酚-3-O-芸香糖苷(批号Y15N8H48277)、紫英云苷(批号Y15S9H70466)、原花青素B1(批号P11N8L48152)、芦丁(批号Y16M9S61523)、表儿茶素(批号K19J9R66088)、山柰酚(批号C26J8Y38642)、白藜芦醇(批号R13M8S 36114)、虎杖苷(批号T31O7F23950)等对照品购自上海源叶生物科技有限公司。槲皮苷、异槲皮苷由本实验室从三叶青中分离制备，1H、13C NMR和MS 数据经文献[9-12]进行比较确认；纯度经 HPLC-DAD (面积归一法)检测含量均大于98.0%。

三叶青采自浙江省、贵州省、云南省等13个不同产地，每个采样点采集2份样品，见表1。原植物经浙江医药高等专科学校彭昕教授鉴定为三叶青。所得药材均置于烘箱中，40 ℃烘干72 h，随后粉碎成细粉备用。

表1 不同产地三叶青地上部分样品信息

2 方法与结果

2.1 样品的制备

精密称定样品粉末0.300 0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入70%甲醇50 mL，精密称定，于超声波细胞破碎仪中超声处理(功率：600 W)60min，取出，放冷，再次称定重量，用70%甲醇补足减失的重量，将萃取液离心15 min，取上清液用0.22 μm 疏水PTFE滤头进行过滤，即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备

取各对照品约10.0 mg，精密称定，分别置于10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，得各对照品贮备液。分别精密量取各对照品贮备液0.5 mL于10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，制备成质量浓度各为50 μg/mL的混合对照品溶液，以0.22 μm 微孔滤膜滤过，于冰箱中保存，备用。

2.3 色谱-质谱条件

液相色谱条件：色谱柱为飞诺美Kinete XB-C18(2.1 mm×100 mm，2.6 μm)；流动相为乙腈溶液(A)-0.1%甲酸水溶液(B)，梯度洗脱，0～1 min，10%A；1～5 min，10%～40%A；5～10 min，40%～60%A；10～11 min，60%～80%A；11～12 min，10%A；体积流速：0.6 mL/min；柱温：40 ℃；进样量：1 μL。

质谱条件：电喷雾电离离子源(ESI)，喷雾电压为4.5 kV；雾化温度为450 ℃；气帘气为35psi；辅助气为40 psi；质谱扫描采用MRM扫描模式；去簇电压(Declustering Potential，DP)参数和碰撞电压(Collision Energy，CE)质谱参数优化通过蠕动针泵注射的方法调谐各标准化合物。所得参数，见表2。

表2 质谱参数信息

2.4 标准曲线的制备

精密量取混合对照品储备液(50 μg/mL)适量，用甲醇稀释，得系列标准溶液浓度，依次为20.0、50.0、100.0、500、1 000 μg/L，以0.22 μm微孔滤膜滤过，在“2.3”项色谱质谱条件下进样分析，以对照品的质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)，建立线性回归方程、相关系数和线性范围，结果见表3。其中混合对照品溶液(100 μg/L)的总离子流，见图1。

表 3 回归方程、相关系数、检出限及定量限

注：1-原花青素B1；2-表儿茶素；3-芦丁；4-异槲皮苷；5-虎杖苷；6-山柰酚-3-O-芸香糖苷；7-紫英云苷；8-槲皮苷；9-白藜芦醇；10-山柰酚。

2.5 方法学考察

2.5.1 检出限和定量限的测定 根据 10种对照品S/N=3时的溶液浓度，计算出检出浓度；根据S/N=10时的对照品溶液浓度，计算出定量浓度。见表3。

2.5.2 精密度实验 分别量取不同浓度的混合对照品溶液(20、100.0、1 000 μg/L)连续测定6次，测得各目标化合物峰面积的RSD范围为1.47%～3.67%，表明仪器精密度良好。

2.5.3 重复性实验 取同一批三叶青样品粉末6份，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，依法测定，计算10种化合物的含量，其RSD范围为 1.96%～4.83%，表明该方法重复性良好。

2.5.4 稳定性实验 取同一供试品溶液，分别在配制后 0、2、4、6、12、24 h依法测定。根据各化合物的峰面积计算RSD值范围为1.18%～3.77%，说明样品溶液在24 h内稳定。

2.5.5 回收率实验 精密称取同一批次已知含量的三叶青样品6份，约0.3 g，精密加入三个不同浓度的 10 种对照品溶液(20、100.0、1 000 μg/L)，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，根据标准曲线测定含量，计算各个化合物回收率范围在97.68%～104.26%，其RSD范围为1.66%～3.83%，表明所用方法回收率良好。

2.6 样品含量测定

精密称量不同产地的三叶青粉末，按“2.1”项制备供试品溶液，依“2.3”项的 UPLC-MS/MS 条件测定，不同产地的三叶青各化合物的含量，见表3。

3 讨论

本研究采集了13个三叶青产区的药材样品，采用UPLC-MS/MS 技术同时测定了山柰酚-3-O-芸香糖苷、紫英云苷、槲皮苷、异槲皮苷、原花青素B1、芦丁、表儿茶素、山柰酚、白藜芦醇、虎杖苷10个指标化学成分的含量。结果表明，本研究所用方法操作简便，精密度、稳定性、重复性好，可用于三叶青药材中10种成分含量的同时测定，研究可为评价三叶青药材的质量提供一种切实可行的参考根据。

本研究测定了13批三叶青的含量，结果表明不同产地三叶青中10种主要成分含量差异很大，同一省份不同城市的药材也有较大差异，甚至有些批次中未检测出某些化合物，这可能与不同种植基地的三叶青引种来源不同以及生态环境的差异性有关。从收集的13批次的平均值来看，三叶青块根中有效成分含量从高到低依次为山柰酚-3-O-芸香糖苷、芦丁 、异槲皮苷 、紫云英苷，原花青素 B1、虎杖苷、槲皮苷、山柰酚、白藜芦醇、表儿茶素。