生脉制剂指纹图谱研究进展

连 艳，邓莉娟

(成都中医药大学 药学院 中药材标准化教育部重点实验室，四川 成都 611137)

随着中医药现代化的不断推进，建立更加科学、系统的中药质量标准是亟待解决的问题。以往依靠一种有效成分的含量测定来控制中药的质量，已经不能适用于中药现代化的进程。中药指纹图谱可以在不清楚全部化学成分的情况下，有效控制中药的质量，提高中药质量的稳定性[1-2]。生脉散出自《医学启源》[3-4]，因其简洁的配伍、显著的临床药效，一直传承至今，形成了生脉饮、生脉胶囊、生脉注射液等多剂型的系列产品。生脉系列产品对于心血管疾病有着良好的治疗效果，改变君药之后的生脉饮(党参方)更是当下人们补气血的常备药。正是这样一个有着悠久历史传承和广泛现代应用的药物，目前却并没有科学、完善的质量标准。国家标准中的单一成分检测已经不能满足药品检测的更高要求，人们开始探索生脉饮系列制剂的指纹图谱，尝试建立一套更加适合中药，更加科学全面的评价体系。目前生脉注射液的指纹图谱研究相对较多，而生脉饮等口服制剂还没有建立标准的指纹图谱。本研究通过简述近20年来指纹图谱技术的发展和中药领域指纹图谱的应用，梳理近年来关于生脉系列制剂的指纹图谱研究，探究其在质量标准建立中的成果和亟待解决的问题。

1 中药指纹图谱概述

1.1 指纹图谱的由来

指纹图谱分析，最早用于法医根据人的指纹进行鉴定[5-7]。人体指纹分为拱形、环形和螺纹形，有一定的相似性，但存在细微区别，每一个人的指纹都是独一无二的，由此我们可以根据指纹找到相对应的人。随着生化科技的发展，“指纹”的特性被运用到各个领域。在生物鉴定方面我们开始应用比传统指纹更精确的DNA指纹图谱作为鉴定标准；在生物分类中，我们可以通过DNA指纹图谱所显示的共性与个性，更好地找到生物之间的联系；在天然药物方面，我们可以通过各种不同的化学分析所得到的指纹图谱来全面展示天然药物中复杂的成分。

1.2 指纹图谱的应用

在推动中药现代化的进程中，许多学者开始尝试采用现代化学手段研究中药；但在诸多的单一成分研究后，人们开始意识到，中药本身的特性就是多成分间的相互作用，而非单一化学药物的简单相加。目前我们尚不能将一味药材或一种中药制剂的所有成分全部分析清楚，但可以依靠指纹图谱，全面展现药材或制剂中的化学成分及相关含量。

国家药品监督管理局于2000年8月发布的《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》中提到：“中药材指纹图谱是指中药材经适当处理后，采用一定的分析手段，得到的能够标示该中药材特性的共有峰的图谱；如原药材需经过特殊炮制(如醋制、酒制、炒炭等)，则应制定原药材和炮制品指纹图谱的检测标准。”[8]世界各地的药品监管机构，如世界卫生组织(WHO)、中国食品药品监督管理局(CFDA)、美国食品药品监督管理局(FDA)、欧洲药品监督管理局(EMA)和韩国食品药品安全部(MFDS)等都认可用指纹图谱的概念来评价中草药的质量[9-10]。

1.3 中药指纹图谱的作用

指纹图谱研究分为两个步骤，第一步是图谱信息的获得；第二步是图谱信息的处理[11-12]。中药指纹图谱可以通过高效液相色谱法、气相色谱法、分光光度法、薄层色谱法等分析方法得到化学成分图谱。不同的分析方法对于成分的体现也是有区别的，目前最为常用和研究最多的是应用高效液相色谱法得到图谱信息。高效液相色谱法可以检测较多的成分，还可以进行含量测定，分析速度快、图谱呈现清晰，适用于中药的指纹图谱研究。中药指纹图谱既可以展示同一药材或制剂的共性成分，也可以体现出成分之间的含量差异。因此，指纹图谱分析常用于判定药材或制剂的真伪，评价药材或制剂的质量高低。

2 中成药指纹图谱研究现状

2.1 中成药指纹图谱概述

中药成方是我国传统医学的重要组成部分，其处方组成依据中医药理论体系的理法方药、辨证施治的基本原则，在疾病的诊疗预防中具有整体观的特点[13-14]。中药在现代化发展的过程中，为适应新时代的快节奏，必须做到开药方便、用药方便。成方制剂往往是多味中药，成分复杂，每一味药材都需要经过严格净制、炮制等多道工序处理，符合饮片标准之后才能投入生产使用。在整个过程中，可能出现药材产地不同、药材加工方式不同、劣品伪品混杂等因素，导致药材质量参差不齐，药品质量难以控制。因此，中成药从新药上市到药品检查，都需要进行严格的成分检查、质量评价。

针对中成药的复杂情况，研究人员开始引入指纹图谱法对中成药进行分析研究和质量评价。色谱法是分析化学领域中发展最为快速、应用最为广泛的方法，也是指纹图谱建立的最常用方法[15-16]。邹纯才等[17]开展指纹图谱研究，将中药色谱指纹图谱相似度评价分为三个阶段：直观比较阶段(1988-1999年)、相似度比较起步阶段(2000-2009年)、相似度评价完善阶段(2010-2017年)；在其文章中，对中药指纹图谱历年的文献数量进行了统计，从表格中可以看出，自2000年后，中药指纹图谱研究开始快速增加，进入黄金发展时期。

盂宪生[18]、张洁等[19]、谢培山等[20]、张铁军等[21]、詹雪艳等[22]、冯碧等[23]采用指纹图谱对不同中成药进行了研究，结果表明指纹图谱可以将药物的大部分化合物特征展现出来，不受成分研究的限制，将化学信息以图谱的形式呈现，直观简洁，这是目前公认的最适合中药及天然药物物质群质量控制的手段之一[24-27]。采用指纹图谱的方法，可以实现对中药的整体性评价，达到有效控制质量的目的。

2.2 《中国药典》关于图谱的应用

1985年版《中国药典》开始将色谱、光谱技术应用于中药的检验标准[28]。从1990年版《中国药典》开始，药材、饮片以及成方制剂的鉴定和测定增加了薄层色谱鉴别，不再是以单一成分检测为主。对照品的设置和薄层色谱特征鉴别的方法已经在逐渐向着更加全面、完善的化学分析方向进步，为指纹图谱的出现和应用埋下了伏笔。2000年国家药品监督管理局颁布了第一版《中药注射剂指纹图谱研究的技术要求(暂行)》，学者们开始对不同的中成药进行了指纹图谱研究。对于研究次数较多、研究内容较完整的药物，《中国药典》对其质量检测标准作出了修改，加入了特征图谱、指纹图谱作为检测标准。从2010年开始，《中国药典》正式将指纹图谱收录为中药检测标准。

2010年版《中国药典》一部加入了6种成方制剂检查项中的指纹图谱[29-31]。其中复方丹参滴丸将指纹图谱加入到质量评价中，对制剂的质量控制水准起到了极大的提高作用，这也是指纹图谱在中成药质量评价中的一次大胆尝试。2015年版《中国药典》比2010年版又新收录了9种成方制剂的指纹图谱[32]。此版药典中记载了标准指纹图谱，严格规定了参照物、共有峰、相似度等标准，使中药质量评价进一步规范化和精准化。到目前为止，包括片剂、颗粒剂、胶囊剂、注射剂等多种剂型均有指纹图谱收载。指纹图谱和特征图谱的加入，为相关药品的检测提供了法定依据，有力保障了药品的质量安全和质量水平。两版《中国药典》中收载指纹图谱的中成药情况统计，见表1。

表1 《中国药典》中收载了指纹图谱的中成药统计

3 生脉系列制品溯源

“生脉散”首载于金元时期张元素所著《医学启源》，定型于《内外伤辨惑论》，完善于《医方考》[13]。根据《医学启源》的记载，该方由人参、麦冬、北五味子组成，主治热伤元气、阴液亏耗的气阴两虚证[13]。近些年生脉散已广泛应用于治疗各类心血管疾病，如病毒性心肌炎、冠心病、心肌缺血、心律失常、心力衰竭等，甚至用于治疗各种休克，成为中医治疗急症的常用方剂[33]。古方生脉散在适应不同临床需求的情况下产生了多种剂型，如口服液、片剂、胶囊剂、注射剂等。常见的生脉饮制剂，又分为党参方和人参方，党参方药味平和，更适宜日常使用，人参方补气效果更强，为了更易吸收，多使用红参，而非生晒参。

3.1 生脉系列制品成分研究

生脉方中的红参、麦冬和五味子均为常用中药，关于其的相关成分研究较多[34]。生脉制剂药味较少，临床使用广泛，全方研究也较多。目前主要采用液相、气相、色谱-质谱联用等方法进行定性、定量分析。生脉制剂化学成分主要包括皂苷类、黄酮类、木脂素、多糖等成分，见表2。

根据表2可知，生脉制剂研究包括传统的成分分析、不同君药对生脉制剂的影响。成分研究中最常用的方法就是高效液相色谱与质谱联用，HPLC法分析速度快、适用性强、各成分分离度高，其与质谱联用可同时判定成分性质和成分含量。随着研究水平的提高，生脉制剂中能确定的化学成分越来越多，检测速度也越来越快。在成分研究的物质基础上，结合动物药理实验、临床案例分析、网络药理模拟等方法，可进一步开展生脉制剂的适用病症、作用机理、质量控制等多方面研究。

表2 生脉制剂主要成分研究进展

3.2 生脉制剂质量标准研究

3.2.1 生脉制剂质量研究现状 通过中国知网对文献进行关键词筛选，选取1979-2020年所收录的所有文献，筛选得到篇名含关键词“生脉”的文献5 202篇；通过检索关键词“临床、病例”，筛选得到临床研究方向文献1 370篇；通过检索关键词“药理、机制、机理”筛选得到药理研究方向文献916篇；通过检索关键词“成分分析、成分、含量、测定”筛选得到成分研究方向文献1 009篇；通过检索关键词“质量控制、质量标准、质量评价、指纹图谱”筛选得到质量研究方向文献244篇；再从244篇关于生脉制剂质量研究的文献中，细分出不同的制剂研究文献。具体情况，见表3。

通过以上分析发现，针对生脉系列不同制剂的研究主要围绕成分研究、药理研究和临床研究，相比较而言，生脉系列制剂的质量研究较少，并集中于某几种有效成分的含量测定，而关于指纹图谱等整体质量控制的研究较少。从研究剂型来看，生脉注射液是研究最多的剂型；其次是口服液。生脉注射液和生脉饮是生脉系列中使用最多的两种类型，所以相关研究较多；其他剂型，如散剂、胶囊、片剂等，使用较少，文献研究也较少。随着中药注射剂安全性和稳定性的提高，生脉注射液已被广泛应用于心血管疾病。在最近的新冠肺炎治疗中，国家颁布的第七版诊疗方案将生脉注射液收载为辅助治疗药物[41]。

目前对生脉饮的主要质控手段是对产品中的单一指标成分进行含量测定。《中国药典》2020版中收录的生脉饮(红参方)和生脉胶囊两种剂型[32]，仅仅采用薄层色谱法鉴别和高效液相色谱法测定单一成分含量。生脉注射液疗效显著，应用广泛，对其研究最多，质量控制也最为严格。2011年颁布的生脉注射液新质量标准中，增加了指纹图谱检测，严格把控注射剂质量；同时生脉注射液的指纹图谱研究较多，供试品制备方法和色谱条件都较为完善，而生脉饮等口服制剂的指纹图谱研究较少，药典等国家标准未加入标准指纹图谱评价体系。

由于成方制剂中化学成分多样，薄层色谱或含量测定对于中药质量控制并不全面，想要整体分析成方制剂，不仅要看主要成分，更要结合临床研究、药理研究，关注有效成分和多成分的协同作用[42-43]。相关研究表明[44-48]，基于代谢组学的“七指标”作为质量标准有助于药品的质量控制，这类用几种主要成分或总含有量的浓度来对目前的质量控制标准进行补充的方法具有一定科学性。近年来，生脉系列制剂的质量评价系统研究和指纹图谱研究日益增加。在成分测定的基础上，质量研究方向有了进一步拓展，开始引入了指纹图谱概念。

3.2.2 生脉口服制剂指纹图谱研究进展 林美斯等[49]、陈建真等[50]研究表明，生脉制剂检验项目通常具有较大局限性，很难在图谱中全面应用。与全成分分析不同，潘晓丽[51]将生脉饮分别用正丁醇和乙酸乙酯提取，建立了生脉饮正丁醇部分和乙酸乙酯部分的对照指纹图谱。2012年王艳慧等[36]应用高效液相色谱与质谱联用技术，进一步对生脉系列产品进行了质量评价分析。指纹图谱研究不是简单的图谱呈现，结合质谱等技术，可以进一步深挖化学信息，全面评价中药质量。

生脉口服制剂类型多样，包括口服液、胶囊剂、片剂、颗粒剂等，还有诸多加味系列产品。但单独一项产品的研究较少，指纹图谱研究局限于简单的高效液相色谱分析，紫外光谱、质谱联用等新技术使用少，多成分含量测定、生物活性成分结合等新方法使用少。口服制剂的质量波动大，质量控制困难，更应该加大对于口服制剂的研究，以控制质量，严格把控生厂加工过程。

3.2.3 生脉注射剂指纹图谱研究进展 关于生脉注射液指纹图谱的研究已经有近20年的历史。随着人们的不断尝试，检验技术不断提高，生脉注射液指纹图谱的建立方法逐渐成熟。在早期研究中，常采用自制中药煎剂进行研究。王勤等[52]、BAI[53]利用HPLC建立参麦注射液的指纹图谱，对图谱中的各个峰进行药材归属分析。近5年来，超高效液相技术使用越来越多。柴瑞平等[54]采用超高效液相色谱法分析生脉注射液，并建立了UPLC指纹图谱，确定了44个共有峰，对其中11个色谱峰相对应的化学成分进行了含量测定。目前，生脉注射液已建立了多张液相色谱指纹图谱，但这只能反映某一波长下化学物质的反应，并不能完整呈现药品的化学特征。目前，物理指纹图谱的研究已逐渐起步，这是中药质量评价方法的新探索方向。梁悦[55]在研究生脉注射液时，结合了八种物理参数，即pH值、折光率、电导率、运动黏度、相对密度、固含物、浊度、渗透压摩尔浓度，建立了生脉注射液的物理指纹图谱，用雷达图的方式直观展现了药品的物理性质。梁悦[56]还建立了生脉注射液的紫外、红外指纹图谱，此为对其质量标准进行再评价研究的大胆探索。

指纹图谱的建立不是简单的将图谱导入软件即可[57-61]。本研究通过分析以HPLC方法建立生脉注射液指纹图谱的文献，统计共有峰与参照峰信息，得到以下研究结果，见表4。

表4 生脉注射液指纹图谱研究进展

根据表4所示，在建立生脉注射液指纹图谱的过程中，最常使用的参照峰为人参皂苷Rb1，人参皂苷Rb1在液相分析中色谱峰分离度高、峰面积较大、保留时间适宜，还是生脉注射液的主要有效成分，所以常常作为参照峰(表5)。分析表5发现，生脉注射液的指纹图谱建立中标定的共有峰大约在20个以上，确定的共有峰对应化学成分一般为含量较多的成分，包括人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、五味子醇甲等。分析指纹图谱中确认的化合物可以看出，生脉注射液的主要成分来自人参。结合成分研究，可知在生脉制剂中麦冬、五味子相关成分体现较少。单一的液相或气相色谱只能勾勒出图谱的形状，结合质谱仪分析，可以确定色谱峰所对应的化合物，通过完善图谱信息，为“一测多评”提供了研究基础。

表5 生脉注射液指纹图谱中确认的化合物

4 结语

中药质量与中药临床疗效息息相关，只有严格进行中药质量控制，才能产生良好的临床效果。随着中成药应用的加大，中成药面临的质量评价、统一精细标准等诸多问题亟待解决。生脉饮作为心血管疾病的常用药，药典所载鉴定和测定标准尚不完善。由于注射液要求严格，差异较小，容易构建指纹图谱，因此目前只有生脉注射液的指纹图谱研究相对较多，并于2013年出版了生脉注射液国家标准指纹图谱。由于口服制剂各厂家、各批次差异略大，现有的指纹图谱研究较少，还没有标准指纹图谱的建立，如何选择特征峰、建立稳定的标准指纹图谱、有效反映产品质量将成为研究的重点和难点。

生脉系列配伍简单，有效成分研究较为清晰，可以进一步改善分析技术，优化质量评价方法，如采用超高效液相、紫外全波段检测、液相色谱-质谱联用、“一测多评”等方法。相信随着检测仪器和检测方法的改进，生脉注射液的质量标准控制将越来越科学完善。

生脉系列有着多种不同的制剂类型，但关于不同剂型间差异的研究较少。目前仅靠单一成分研究，不同剂型间的差异难以发现。生脉制剂中有人参方和党参方，但关于这两者的化学成分对比、药效对比、临床应用差异等研究较少。指纹图谱研究也只是针对一种药物分析，没有比较研究。如果能够建立生脉系列不同剂型的指纹图谱，以共有成分作为参照，就能清晰反映不同剂型间成分的含量分布区别，进一步研究不同剂型的成分与药效差别。

开展指纹图谱研究，一般是为了制定药物的质量检测和评价标准，但光这些远远不够。指纹图谱的化学信息、药效学的对症研究、病例的临床分析，这些综合相加，才能体现完整的中药信息学。总之，中医药现代化是一个浩大的工程，还有漫长的道路要走，指纹图谱研究只是中医药现代化的一个小推手、一块发展的小基石，但也正是这一块块基石，才搭建起了中医药现代化的高楼。