基于HPLC指纹图谱和主成分分析方法评价不同产地延胡索的质量

杨敏娟，杨小龙，黄银平，孙冬梅，魏 梅

(广东一方制药有限公司，广东 佛山 528244)

延胡索为罂粟科紫堇属植物延胡索CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥块茎，功能与主治为活血、行气、止痛[1]。延胡索适应能力强，生长周期短，分布广泛。主产于浙江东阳和磐安、陕西汉中、安徽芜湖、江苏南通、重庆等地[2]。延胡索的化学成分主要有异喹啉型生物碱，以及有机酸、淀粉、皂醇类、粘液质、树脂、皂苷类和无机元素。据文献报道，从延胡索中分离鉴定出40多个化合物，分别为原阿片碱类、原小檗碱类、异喹啉苯并菲啶类、阿朴菲类、异喹啉苄咪唑类、双苄基异哇琳类等，其中，原小檗碱类最多[3]。

指纹图谱在现代分析技术的基础上，可以标示中药材特征性的图谱[5]。它具有整体性，能够全面体现中药材的化学成分，已成为中药材控制质量、鉴别真伪的重要方法[4]。主成分分析法是应用现代分析软件SPSS的统计方法[5]，依据贡献率大小筛选具有代表性的成分因子。近年来主成分分析法结合指纹图谱[6-9]，成为一种独具特色的多指标评价技术。本研究在对延胡索产地进行实地调研的基础上，共收集了30批延胡索药材，分别产自陕西、浙江、安徽以及江苏。采用高效液相色谱法建立延胡索药材指纹图谱，结合质谱技术和主成分分析法，探讨延胡索药材产地的形成原因，为延胡索今后的开发利用、科学评价以及质量控制提供了基础实验依据。

1 材料与仪器

延胡索购自各产地，经广东一方制药有限公司质量中心鉴定为CorydalisyanhusuoW.T.Wang的干燥块茎，详细信息见表1。原阿片碱(含量：99.7%，批号：110853-201404)、盐酸巴马汀(含量：87.4%，批号：110732-201510)、盐酸小檗碱(含量86.8%，批号：110713-201613)、延胡索乙素(含量：99.8%，批号：110726-201516)均购自中国食品药品检定研究院；盐酸药根碱(批号：wkq-00629，含量均>98%)、去氢紫堇碱(批号：wkq16090204，含量均>98%)、紫堇碱(批号：wkq17060802，含量均>98%)均购自四川省维克奇生物科技有限公司；色谱级磷酸、三乙胺、乙腈、甲醇(德国默克股份有限公司)；水为超纯水，其他为分析纯；高效液相色谱仪(沃特斯公司)，Agilent 1260分析型高效液相色谱仪(安捷伦公司)；Agilent 6210 LC/MSD TOF质谱仪(安捷伦公司)，ME204E分析天平(梅特勒-托利多公司)，数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

表1 不同产地延胡索药材信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

2.1.1 指纹图谱色谱条件 色谱柱为phenomenex Luna C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；进样量为10μL；柱温为30 ℃；检测波长为280 nm；流速为0.8 mL/min；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B，按0～15 min，10%→17%A；15～65 min，17%→30%A；65～85 min，30%→55%A；85～105 min，55%→80%A；105～115 min，80%→85%A；115～116 min，85%→10%A；116～130 min，10%A进行梯度洗脱。

2.1.2 指认色谱条件 色谱柱为Waters XBridge C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)；以乙腈为流动相A，0.01%氯化铵溶液为流动相B，按0～10 min，10%→17%A；10～25 min，25%A；25～35 min，25%→26%A；35～60 min，26%→95%A进行梯度洗脱；流速为1.0 mL/min；柱温为30 ℃；检测波长为280 nm。

2.2 质谱条件

离子源为ESI (正离子模式)；干燥器温度为325 ℃；干燥气流速为10 L/min；毛细管电压为4.0 kV；扫描质核比范围为100～1 500；自动参比离子为121.050 9和922.009 8。

2.3 溶液的制备

2.3.1 参照物溶液的制备 精密称取原阿片碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素和紫堇碱对照品适量，加甲醇溶解，制成质量浓度分别约为100μg/mL的混合溶液，过0.22μm微孔滤膜，即得。

2.3.2 供试品溶液的制备 取本品粉末(过三号筛)约0.6 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇25 mL，称定重量，超声处理(功率200 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称定重量，用稀乙醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4 指纹图谱的方法学考察

2.4.1 重复性试验 取S1样品，按“2.3.2”项下方法平行制备6份，按“2.1”项下的色谱条件分别检测，结果显示，各峰的相对保留时间和相对峰面积RSD均小于2.0%，该方法重复性良好。

2.4.2 稳定性试验 取重复性试验供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件，分别在0，2，4，8，12，16，20，24 h进样检测，结果显示，各峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3.0%，该供试品溶液在24 h内稳定。

2.4.3 精密度试验 取重复性试验供试品溶液，按“2.3.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下的色谱条件分析连续进样6次，结果显示，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD值均小于3.0%，该方法精密度良好。

2.5 色谱峰的指认

取上述供试品溶液，按“2.2”项下条件进行测定。通过色谱峰的保留时间、光谱数据以及与对照品进行比对，延胡索药材指纹图谱中7个色谱峰得到了明确的指认。根据保留时间先后，它们分别为原阿片碱、盐酸药根碱、延胡索乙素、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱和紫堇碱，如图1所示，各色谱峰的峰号、保留时间、名称、CAS号、分子式和结构式见表2。

表2 延胡索药材指纹图谱色谱峰的指认

图1 延胡索药材指纹图谱色谱峰指认色谱

2.6 延胡索药材指纹图谱的建立

取30批延胡索药材，按“2.2.3”项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液，按“2.2.1”项下的色谱条件进样分析，结果见表3；将结果导入国家药典委员会推荐的“中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)”，以S1样品为参照谱，时间窗宽度设为0.10s，计算各产地延胡索与对照指纹图谱的相似度，结果见图2、图3和表4。结果表明，30批延胡索药材中有16个共有峰，各色谱峰相对保留时间RSD值均小于2.0%，相对峰面积RSD值范围为28.0%～117.2%；30批延胡索药材相似度范围为0.835～0.999，四个产地的延胡索质量有一定差异。

图3 不同产地延胡索药材指纹图谱叠加

表3 延胡索药材指纹图谱共有峰的相对保留时间和相对峰面积结果

表4 不同产地延胡索药材指纹图谱的相似度评价结果

2.7 主成分分析

采用SPSS 19.0统计软件对不同产地延胡索药材指纹图谱的共有峰峰面积进行主成分分析，计算初始因子载荷矩阵及累积贡献率。

不同产地延胡索药材指纹图谱的主成分分析结果见表5，初始因子载荷矩阵见表6。以特征值>1为界限，提取到4个主成分，其累计方差贡献率为84.72%。由表7可知，第1主成分的特征根为7.448，累计贡献率为46.55%，成分4、5、7、8、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱及16在第1主成分上有较高载荷，说明第1主成分主要反映了以上8个成分的信息；第2主成分特征根为2.663，累计贡献率为16.64%，主要反映了2、原阿片碱、盐酸药根碱、7、12及15成分的信息。以主成分为变量得到载荷图和得分图，见图5。由载荷图可知，距离原点较远的是主成分1和2中权重值大的成分，其在决定产地差异上具有重大作用。由得分图可知，整体上各产地延胡索药材分布比较集中，S22样品比较离群。

注：峰3：原阿片碱；峰6：盐酸药根碱；峰9：盐酸巴马汀；峰10：盐酸小檗碱；峰11：去氢紫堇碱；峰13：延胡索乙素；峰14：紫堇碱。

表5 主成分分析结果

表6 初始因子载荷矩阵

图4 不同产地延胡索的载荷图(上)和得分图(下)

2.8 不同产地延胡索药材的综合评价

用4个主成分对不同产地的延胡索药材进行综合评价，计算综合得分，结果如表7所示。由表7可知，排名前10的样品中，有陕西、浙江、安徽、江苏产地的样品各7批、1批、2批、0批；分别占其总样品数的46.7%、11.1%、66.7%及0；排名前20的样品中，陕西、浙江、安徽、江苏产地的样品各12、3、3、2批，分别占其总样品数的80%、33.3%、100%及66.7%。

表7 不同产地延胡索药材综合得分结果 (n=30)

3 讨论

不同产地的延胡索药材指纹图谱有16个共有峰，应用质谱共指认了7个色谱峰，它们分别为原阿片碱、盐酸药根碱、盐酸巴马汀、盐酸小檗碱、去氢紫堇碱、延胡索乙素和紫堇碱。根据准分子离子峰信息，并结合文献，在总离子流图中，保留时间为19.454 min的色谱峰在一级质谱图中给出m/z356.187 8，为准分子离子峰[M+H]+(C21H25NO4)，推测其可能为四氢巴马汀[11-13]；保留时间为12.077 min的色谱峰在一级质谱图中给出m/z342.172 7，为准分子离子峰[M+H]+(C20H23NO4)，推测其可能为四氢非洲防己胺[10-14]。

延胡索自然分布在浙江、安徽、江苏、湖北、河南一带。500年前开始在江苏茅山栽培，后向南迁移至杭州，最后又向南迁移至浙江中部的东阳、磐安一带，后续形成有名的“浙八味”之一[15]。现代所用的元胡绝大部分来自栽培品，并以浙江东阳一带所产为道地，我国不少地区引种栽培都获得了成功，如陕西、四川等地。陕西引种的延胡索主要分布在陕南汉中一带，以汉中市城固县董家营村的延胡索栽培为汉中市延胡索引种成功的典范。从相似度、得分图及综合得分结果来看，三者相互印证，相似度较低的S22样品，得分图中较离群，综合得分较低，排名靠后。从相似度、得分图可以看出，15批产自陕西的延胡索药材整体与浙江产地的延胡索较接近，这也间接说明陕西汉中市延胡索引种的成功。当然，影响中药材的质量是多方面的，比如气候、环境、生长年限以及药农的栽培等因素，所以建立具有专属性和特征性的评价体系是非常有必要的。

本研究通过全波3D扫描优选延胡索药材指纹图谱最佳吸收波长，考察了不同流动相系统(乙腈-0.1%磷酸(三乙胺调pH值至6.0)、乙腈-0.1%磷酸(0.22%三乙胺)、乙腈-1%醋酸-醋酸铵缓冲液(pH6.0))、不同柱温(25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、不同流速(0.7 mL/min、0.8 mL/min、0.9 mL/min、1.0 mL/min)，最终以“柱温为30 ℃；检测波长为280 nm；流速为0.8 mL/min；以乙腈为流动相A，以0.1%磷酸为流动相B”色谱条件时，指纹图谱色谱峰的分离度、对称因子以及峰的个数较优；考察了不同提取溶剂(水、稀乙醇、70%乙醇、甲醇、浓氨试液-甲醇(1∶20))、提取方式(超声、回流)、提取时间(20 min、30 min、40 min)，最终以“稀乙醇为提取溶剂，超声处理为提取方式，提取30 min”色谱峰的个数较多，对称因子较好。