MiR-338-3p 通过靶向WNK1 影响食管癌细胞增殖、迁移、侵袭及凋亡的机制研究

2021-11-17吴凯,任强

中国比较医学杂志 2021年10期

吴凯,任强

(淮北矿工总医院心胸外科,安徽淮北 235000)

食管癌是临床常见的恶性肿瘤,近年来,食管癌发病率逐年上升,基因异常表达、致癌信号通路的激活等均可促进食管癌的发生[1]。 miRNA 属于非编码单链小RNA 分子,其可通过与靶基因结合从而调控靶基因表达,miRNA 异常表达可影响多种肿瘤发生及发展[2]。既往研究显示miRNA 表达上调或下调均可能参与食管癌发生及发展过程,并可通过调控靶基因表达从而影响食管癌细胞增殖、凋亡等生物学行为[3-5]。 miR-338-3p 在胃癌组织中表达下调[6]。生物信息学分析显示WNK1 可能是miR-338-3p 的靶基因,研究表明WNK1 表达量升高并可能促进肾癌发生及发展[7]。但miR-338-3p 是否可通过靶向WNK1 影响食管癌发生发展过程尚未可知。因此,本研究通过检测食管癌细胞系中miR-338-3p、WNK1 的表达,探讨 miR-338-3p 对食管癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的影响及二者的靶向关系。

1 材料和方法

1.1 细胞

人正常食管上皮细胞株Het-1A、人食管癌细胞Eca-109、EC-1、EC9706 购自美国 ATCC 公司。

1.2 主要试剂与仪器

DMEM、胎牛血清、青霉素、链霉素、Opti-MEM减血清培养基购自美国 Gibco 公司;miR-338-3p mimics、miR-con、si-WNK1、si-con、anti-miR-338-3p、anti-miR-con 购自上海吉玛制药技术有限公司;qRTPCR 试剂盒(20181203)购自北京天根生化科技有限公司;MTT(20181116)购自上海泽叶生物科技有限公司;细胞凋亡试剂盒(APOAF MSDS)购自美国Sigma 公司;双荧光素酶活性检测试剂盒购自北京索莱宝;兔抗人WNK1 抗体购自武汉友联特生物技术有限公司;兔抗人 PCNA、MMP-2、MMP-9、Cleaved caspase-3 抗体购自美国 Santa Cruz 公司;StepOnePlus 实时荧光定量PCR 仪购自美国ABI 公司;FACS Calibur 流式细胞仪购自美国BD 公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞转染及实验分组

取对数生长期 EC9706 细胞,待细胞生长至70%融合度时将培养基更换为Opti-MEM 减血清培养基,参照Lipofectamine2000 转染试剂分别将miR-con、miR-338-3p mimics、si-con、si-WNK1、miR-338-3p mimics 与 pcDNA、miR-338-3p mimics 与 pcDNAWNK1 转染至EC9706 细胞,分别记作miR-con 组、miR-338-3p 组、si-con 组、si-WNK1 组、miR-338-3p+pcDNA 组、miR-338-3p+pcDNA-WNK1 组。同时将未经转染的EC9706 细胞作为NC 组。

1.3.2 qRT-PCR 检测细胞中 miR-338-3p、WNK1 mRNA 的表达水平

收集 Het-1A、Eca-109、EC-1、EC9706 细胞及各组转染后的EC9706 细胞,采用TRIzol 法提取细胞中的总RNA。检测RNA 浓度与纯度。反转录合成cDNA。 qRT-PCR 反应条件:95℃ 120 s,94℃ 45 s,60℃ 30 s,70℃ 45 s,共 40 次循环。计算 miR-338-3p、WNK1 mRNA 的相对表达量。 miR-338-3p 正向引物 5’-ATCCAGTGCGTGTCGTGG-3’,反向引物5’-TGCTTCCAGCATCAGTGAT-3’;WNK1 正向引物5’-CAGAGTGAGCAGCCAACAGA-3’,反向引物 5’-CCACGGACTGAGGCATACTT-3’;β-actin 正向引物5’-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3’,反向引物 5’-CCCATACCCACCATCACACC-3’;U6 正向引物 5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3 ’, 反向引物 5 ’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.3.3 MTT 检测细胞增殖

EC9706 细胞每毫升 2.5×104个接种于 96 孔板,每孔 100 μL,加 MTT 溶液 20 μL,继续培养 4 h,弃上清,每孔加入150 μL DMSO,应用酶标仪检测各孔吸光度值(OD)。

1.3.4 流式细胞术评估EC9706 细胞凋亡率

EC9706 细胞在 500 μL 结合缓冲液中重悬,参照试剂盒说明书操作,应用流式细胞仪、FlowJo 软件分析各组EC9706 细胞的凋亡率。

1.3.5 Transwell 实验测定 EC9706 细胞迁移及侵袭

EC9706 细胞迁移测定:将各组转染后的EC9706 细胞(每毫升 2×105个),Transwell 小室上室与下室分别加入细胞悬浮液(200 μL)与DMEM培养基(600 μL),继续培养24 h,多聚甲醛固定后进行结晶紫溶液染色,观察迁移细胞数。 EC9706 细胞侵袭实验:Transwell 小室上室使用稀释的Matrigel基质胶(100 μL),包被 5 h。后续按照 EC9706 细胞迁移测定的步骤检测侵袭细胞数。

1.3.6 双荧光素酶报告基因检测miR-338-3p 的靶基因

TargetScan 预测 miR-338-3p 与 WNK1-3’UTR存在结合位点,构建野生型载体WT-WNK1、突变型载体 MUT-WNK1(美国 Promega 公司),于 EC9706细胞中分别共同转染 WT-WNK1、MUT-WNK1 与miR-con、miR-338-3p mimics,收集 48 h 后的 EC9706细胞进行荧光素酶活性测定。

1.3.7 Western blot 检测 EC9706 细胞中 WNK1 蛋白、PCNA 蛋白、Cleaved caspase-3 蛋白、MMP-2 蛋白及MMP-9 蛋白表达

提取细胞总蛋白,BCA 法检测蛋白浓度,SDSPAGE 分离蛋白,转膜,封闭2 h,依次分别加入一抗稀释液与二抗稀释液,通过Image J 软件进行各条带灰度值的分析。

1.4 统计学方法

实验数据在SPSS 21.0 统计学软件中整理分析,结果表示为平均数±标准差(),两组间、多组间数据比较分别采用独立样本t检验、单因素方差分析,P<0.05 代表差异显著,具有统计学意义。

2 结果

2.1 正常食管上皮细胞和食管癌细胞中miR-338-3p 和 WNK1 的表达

见图 1、表 1,qRT-PCR 法与 Western blot 法分别检测食管癌细胞Eca-109、EC-1、EC9706 中miR-338-3p、WNK1 mRNA 及蛋白的表达量,结果显示,食管癌细胞 Eca-109、EC-1、EC9706 中 miR-338-3p 的表达量显著低于Het-1A 细胞,WNK1 mRNA 和WNK1蛋白的表达量显著高于Het-1A 细胞(P<0.05)。表明miR-338-3p 在食管癌中呈低表达,而WNK1 在食管癌细胞中呈高表达。

图1 正常食管上皮细胞和食管癌细胞中WNK1 蛋白表达Figure 1 WNK1 protein expression in normal esophageal epithelial cells and esophageal cancer cells

表1 qRT-PCR 检测正常食管上皮细胞和食管癌细胞中miR-338-3p 和 WNK1mRNA 的表达及Western blot检测WNK1 蛋白的表达(,n=9)Table 1 qRT-PCR to detect the expression of miR-338-3p and WNK1mRNA in normal esophageal epithelial cells and esophageal cancer cells, and Western blot to detect the expression of WNK1 protein

注:与Het-1A 组相比较,*P<0.05。Note. Compared with the Het-1A group, *P<0.05.

分组Groups miR-338-3p WNK1 mRNA WNK1 蛋白WNK1 protein Het-1A 1.04±0.07 0.99±0.12 0.34±0.04 Eca-109 0.52±0.08* 4.04±0.40* 0.53±0.06*EC-1 0.48±0.06* 4.58±0.45* 0.69±0.07*EC9706 0.39±0.05* 5.15±0.48* 0.82±0.08*F 178.121 204.239 93.745 P 0.000 0.000 0.000

2.2 转染miR-338-3p 抑制食管癌细胞EC9706 增殖和诱导细胞凋亡

见图2、表2,MTT 法、流式细胞术分别检测细胞活力及凋亡率,采用 Western blot 法检测 PCNA、Cleaved caspase-3 蛋白表达量,结果显示,miR-338-3p 组食管癌细胞EC9706 的细胞活力、PCNA 蛋白表达量低于miR-con 组(P<0.05),而细胞凋亡率和Cleaved caspase-3 蛋白表达量显著高于miR-con 组(P<0.05)。表明miR-338-3p 过表达能够抑制食管癌细胞增殖及促进细胞凋亡。

表2 转染miR-338-3p 对食管癌细胞EC9706 凋亡和PCNA、Cleaved caspase-3 蛋白表达生物影响(,n=9)Table 2 Biological effects of miR-338-3p transfection on apoptosis and expression of PCNA and cleaved caspase-3 protein in esophageal cancer cell line EC9706

注:与miR-con 组相比较,*P<0.05。Note. Compared with miR-con group, *P<0.05.

分组Groups miR-338-3p PCNA Cleaved caspase-3 细胞凋亡率(%)Cell apoptosis rate 细胞活力(%)Cell viability NC 0.98±0.08 0.58±0.07 0.22±0.02 2.92±0.35 101.32±5.44 miR-con 0.94±0.11 0.62±0.08 0.25±0.03 3.45±0.56 97.36±6.58 miR-338-3p 7.58±0.68* 0.29±0.06* 0.72±0.07* 15.26±1.44* 63.45±5.93*F 820.192 58.772 342.435 523.627 108.266 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

图2 转染miR-338-3p 对食管癌细胞EC9706 凋亡和PCNA、Cleaved caspase-3 蛋白表达生物影响Note. A, Detection of PCNA and Cleaved caspase-3 protein expression in cells by transfection of miR-338-3p. B, Detection of cell apoptosis by transfection of miR-338-3p.Figure 2 Biological effects of miR-338-3p transfection on apoptosis and expression of PCNA and cleaved caspase-3 protein in esophageal cancer cell line EC9706

2.3 转染miR-338-3p 抑制食管癌细胞EC9706 迁移和侵袭

Transwell 实验检测细胞迁移及侵袭,Western blot 法检测 MMP-2、MMP-9 蛋白水平,结果显示,与miR-con 组比较,miR-338-3p 组食管癌细胞EC9706的迁移细胞数、侵袭细胞数、MMP-2、MMP-9 蛋白水平显著降低(P<0.05),见图3、表3。表明miR-338-3p 过表达可抑制食管癌细胞迁移及侵袭。

表3 转染miR-338-3p 抑制食管癌细胞EC9706 迁移和侵袭(,n=9)Table 3 Transfection of miR-338-3p inhibits migration and invasion of esophageal cancer cell line EC9706

注:与miR-con 组相比较,*P<0.05。Note. Compared with the miR-con group, *P<0.05.

Groups MMP-2 MMP-9 迁移细胞数Cell migration number分组侵袭细胞数Cell invasion number NC 1.12±0.09 0.77±0.08 294.53±15.73 127.64±8.37 miR-con 1.15±0.11 0.74±0.08 278.59±19.17 117.92±11.70 miR-338-3p 0.62±0.07* 0.44±0.05* 114.04±8.48* 62.64±5.74*F 95.343 58.765 392.503 138.349 P 0.000 0.000 0.000 0.000

图3 转染miR-338-3p 对食管癌细胞EC9706 中迁移、侵袭、MMP-2 和MMP-9 蛋白表达的影响Note. A, Detection of cell migration and invasion by transfection of miR-338-3p. B,Detection of MMP-2 and MMP-9 protein expression in cells by transfection of miR-338-3p.Figure 3 Effects of miR-338-3p transfection on migration, invasion and expression of MMP-2 and MMP-9 in EC9706 cells

2.4 miR-338-3p 靶向、调控 WNK1

TargetScan 软件预测发现miR-338-3p 与WNK1存在互补序列,见图4A。双荧光素酶报告实验结果显示miR-338-3p 过表达可降低WT-WNK1 荧光素酶活性(P<0.05),而对MUT-WNK1 荧光素酶活性无明显影响(P>0.05),见表4。与miR-con 组比较,miR-338-3p 组细胞中WNK1 蛋白水平显著降低(P<0.05);与 anti-miR-con 组比较,anti-miR-338-3p 组细胞中WNK1 蛋白水平显著升高(P<0.05),见图4B、表 5。表明 miR-338-3p 可靶向结合 WNK1,并可负向调控WNK1 的表达。

表4 双荧光素酶报告实验(,n=9)Table 4 Double luciferase report experiment

注:与 miR-con 组比较,*P<0.05。Note. Compared with miR-con group, *P<0.05.

分组Groups野生型WNK1WT-WNK1突变型WNK1MUT-WNK1 miR-con 1.07±0.07 1.12±0.09 miR-338-3p 0.55±0.08* 1.15±0.08 t 14.675 0.747 P 0.000 0.466

表5 miR-338-3p 靶向调控WNK1 表达(,n=9)Table 5 miR-338-3p targets WNK1 expression

注:与 miR-con 组比较,*P<0.05;与 anti-miR-con 组比较,#P<0.05。Note. Compared with miR-con group, *P<0.05. Compared with antimiR-con group, #P<0.05.

分组Groups WNK1 miR-con 0.63±0.06 miR-338-3p 0.28±0.04*anti-miR-con 0.58±0.06 anti-miR-338-3p 1.25±0.09#F 353.112 P 0.000

图4 miR-338-3p 与WNK1 存在互补序列并调控WNK1 蛋白表达Note. A, miR-338-3p and WNK1 had complementary sequences. B, Western blot was used to detect the expression of WNK1 protein.Figure 4 miR-338-3p has complementary sequence with WNK1 and regulates WNK1 protein expression

2.5 沉默WNK1 抑制食管癌细胞增殖、迁移和侵袭

MTT 法、流式细胞术、Transwell 实验分别检测细胞活力、凋亡率、迁移及侵袭,Western blot 法检测PCNA、MMP-2、MMP-9、Cleaved caspase-3 蛋白水平,结果显示,与 si-con 组比较,si-WNK1 组 EC9706 细胞活力、PCNA、MMP-2 和 MMP-9 蛋白表达量显著减少,而EC9706 细胞凋亡率和Cleaved caspase-3 蛋白水平明显增强,迁移细胞数与侵袭细胞数显著减少(P<0.05),见图5、表 6。表明沉默 WNK1 可抑制食管癌细胞增殖、迁移及侵袭。

表6 沉默WNK1 抑制食管癌细胞EC9706 增殖、迁移和侵袭(,n=9)Table 6 Silencing WNK1 inhibits proliferation, migration and invasion of esophageal cancer cell line EC9706

注:与 si-con 组比较,*P<0.05。Note. Compared with the si-con group, *P<0.05.

分组Groups WNK1 PCNA Cleaved caspase-3 MMP-2 MMP-9迁移细胞数Cell migration number侵袭细胞数Cell invasion number细胞凋亡率(%)Cell apoptosis rate细胞活力(%)Cell viability NC 0.71±0.07 0.55±0.04 0.25±0.02 0.73±0.05 0.61±0.04 291.53±18.26 121.94±9.84 3.25±0.65 99.72±5.49 si-con 0.68±0.05 0.52±0.05 0.28±0.03 0.70±0.07 0.63±0.06 285.07±19.42 114.34±11.96 3.82±0.76 95.37±7.41 si- WNK1 0.17±0.04* 0.22±0.03* 0.82±0.08* 0.35±0.03* 0.32±0.05* 94.43±8.27* 55.07±6.64* 15.81±1.54* 68.68±5.86*F 276.300 179.820 360.818 145.193 105.545 434.622 127.450 402.845 63.879 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

图5 沉默WNK1 对食管癌细胞EC9706 凋亡、迁移、侵袭和WNK1、PCNA、MMP-2 及MMP-9 蛋白表达的影响Note. A, Silencing WNK1 to detect cell apoptosis. B, Detection of WNK1,PCNA,MMP-2 and MMP-9 protein expression in cells by silencing WNK1. C,Detection of cell migration and invasion by silencing WNK1.Figure 5 Effects of WNK1 silencing on apoptosis, migration, invasion and protein expression of WNK1, PCNA, MMP-2 and MMP-9 in esophageal cancer cell line EC9706

2.6 过表达WNK1 部分逆转miR-338-3p 对食管癌细胞的抑制作用

MTT 法、流式细胞术、Transwell 实验分别检测细胞活力、凋亡率、迁移及侵袭,Western blot 法检测PCNA、MMP-2、MMP-9、Cleaved caspase-3 蛋白水平,结果显示,与miR-338-3p +pcDNA 组比较,miR-338-3p +pcDNA- WNK1 组 EC9706 细胞的活力、PCNA、MMP-2、MMP-9 蛋白水平比 miR-338-3p +pcDNA 组显著增加, 但 EC9706 细胞凋亡率和 Cleaved caspase-3 蛋白水平较 miR-338-3p +pcDNA 组显著减少,且EC9706 细胞的迁移、侵袭细胞数比miR-338-3p +pcDNA 组显著提高(P<0.05),见表 7、图6。表明WNK1 过表达能够拮抗miR-338-3p 过表达对食管癌细胞增殖、迁移及侵袭的抑制作用。

图6 miR-338-3p 和过表达WNK1 对食管癌细胞EC9706 凋亡、迁移、侵袭和WNK1、PCNA、MMP-2 及MMP-9 蛋白表达的影响Note. A, Detection of apoptosis by miR-338-3p and overexpression of WNK1. B, Detection of miR-338-3p and overexpression of WNK1 on cell migration and invasion. C, miR-338-3p and overexpression of WNK1 affect the expression of WNK1, PCNA, MMP-2 and MMP-9 proteins in cells.Figure 6 Effects of miR-338-3p and WNK1 overexpression on apoptosis, migration, invasion and protein expression of WNK1,PCNA, MMP-2 and MMP-9 in esophageal cancer cell line EC9706

表7 miR-338-3p 和过表达WNK1 抑制食管癌细胞EC9706 增殖、迁移和侵袭(,n=9)Table 7 miR-338-3p and WNK1 overexpression inhibit proliferation, migration and invasion of esophageal cancer cell line EC9706

注:与 miR-338-3p+pcDNA 组比较,*P<0.05。Note. Compared with miR-338-3p+pcDNA group, *P<0.05.

分组Groups WNK1 PCNA Cleaved caspase-3 MMP-2 MMP-9迁移细胞数Cell migration number侵袭细胞数Cell invasion number细胞凋亡率(%)Cell apoptosis rate细胞活力(%)Cell viability miR-338-3p+pcDNA 0.35±0.05 0.28±0.04 0.68±0.05 0.32±0.06 0.39±0.04 113.37±18.48 51.86±6.64 15.92±1.53 98.31±8.46 miR-338-3p+pcDNAWNK1 0.54±0.06* 0.63±0.07* 0.44±0.06* 0.78±0.07* 0.65±0.06*194.58±12.26* 84.27±7.39* 7.28±1.06* 142.54±15.83*F 19.359 13.024 9.219 14.968 10.817 10.994 9.787 13.926 7.393 P 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000

3 讨论

miR-338-3p 在肾癌、宫颈癌、非小细胞肺癌细胞中表达下调,并可调控细胞的生物学过程,如增殖、迁移及侵袭等[8-10]。本研究数据表明,miR-338-3p 在食管癌细胞系 Eca-109、EC-1、EC9706 中的表达下调,与上述研究结果相似,提示miR-338-3p 在食管癌发生过程中可能发挥抑癌基因作用。本研究结果显示miR-338-3p 过表达后食管癌细胞增殖能力显著降低,进一步分析显示miR-338-3p 过表达后可抑制食管癌细胞中PCNA 的表达,PCNA 表达量升高可促进细胞增殖[11]。本研究结果提示miR-338-3p 过表达可能通过抑制食管癌细胞PCNA 的表达,发挥抗食管癌增殖、迁移及侵袭,和促食管癌细胞凋亡的作用,还可增强Cleaved caspase-3 表达,抑制 MMP-2、MMP-9 表达,与相关文献报道相似[12-13]。提示miR-338-3p 过表达可促进细胞凋亡及抑制食管癌细胞迁移及侵袭。

miR-93 通过抑制WNK1 表达从而抑制三阴性乳腺癌细胞迁移及侵袭[14]。研究表明WNK1 在肿瘤细胞中表达上调并可促进细胞迁移[15]。与上述研究结果相似,本研究结果显示WNK1 在食管癌中表达上调,沉默WNK1 表达能减弱食管癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,并诱导食管癌细胞的凋亡,双荧光素酶报告实验进一步证实WNK1 是miR-338-3p 的靶基因。本研究结果显示WNK1 过表达后,miR-338-3p 过表达调控食管癌细胞增殖、凋亡、迁移及侵袭的作用被逆转。

综上所述,miR-338-3p 在食管癌细胞中呈低表达,WNK1 的表达量明显升高,miR-338-3p 过表达可抑制食管癌细胞增殖、迁移及侵袭,并可促进细胞凋亡,其作用机制可能与靶向WNK1 而上调Cleaved caspase-3 表达及抑制 PCNA、MMP-2、MMP-9 表达有关,miR-338-3p 可能成为食管癌靶向治疗的潜在靶点。但仍需进行体内动物实验验证miR-338-3p 的抑癌基因作用。