CALML3鉴别诊断肺腺癌和鳞状细胞癌的潜在价值分析

苏培渊，杨 清，付 兵，陈岳威，黄文辉

成都中医药大学附属医院胸心外科，四川成都 610075

肺癌是全球范围内对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，其死亡率位居恶性肿瘤的首位[1-2]。肺癌患者中约有85%的患者为非小细胞肺癌，其中约50%的非小细胞肺癌患者组织病理学分类属于肺腺癌(LUAD)，约30%的患者组织病理学分类属于肺鳞状细胞癌(LUSC)。LUAD和LUSC在转录组水平、细胞网络调控、预后特征及治疗反应中的表现明显不同[3-4]。因此，准确区分这2种亚型对于肺癌的诊断和治疗尤为重要。

近年来，随着医学技术的不断发展和提高，肺癌的治疗模式已从依据分期制订治疗方案的模式转变为依据基因组学、组织学分类制订精准治疗方案的先进治疗模式。因此，如何精准鉴别LUAD和LUSC，对肺癌的靶向治疗起到关键作用。目前，LUAD和LUSC实验室的鉴别诊断常见标志物主要为甲状腺转录因子-1(TTF-1)、新天门冬氨酸蛋白酶A(NapsinA)、肿瘤蛋白p63(TP63)、细胞角蛋白(CK)5/6/7，其对肺癌鉴别诊断的准确率可达到75%以上[3,5]。然而，现有的实验室标志物对肺癌鉴别诊断准确率仍然无法让临床满意，需要发现新的、更高诊断准确率的标志物用于肺癌的鉴别诊断。

钙调蛋白样蛋白3(CALML3)是一种钙敏感蛋白，其对细胞黏附和运动起重要调控作用。研究发现CALML3在乳腺癌、胃癌、肝癌中作为抑癌基因，在肿瘤组织中表达明显降低[6]。CHEN等[6]通过免疫组化检测发现，CALML3在LUAD和LUSC中表达升高，且能够作为有效鉴别区分LUAD和LUSC的免疫组化标志物。但CALML3 mRNA在肺癌组织的表达情况，以及能否作为一个定量生物标志物有效区分LUAD和LUSC还有待研究。

本研究系统地对癌症基因组图谱(TCGA)数据库中CALML3测序数据进行综合分析，探讨CALML3 mRNA在LUAD和LUSC中的表达水平、预后价值，以明确CALML3作为区分LUAD和LUSC的候选标志物的可能。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2019年3—12月在本院胸心外科接受根治性手术的肺癌患者，年龄42～72岁，中位年龄56岁，收集患者相关资料如性别、年龄、吸烟情况、肿瘤分期、肿瘤亚型及淋巴结转移程度等。手术留取其癌组织及其癌旁正常组织标本(距离肿瘤边缘5 cm以上)。纳入标准：标本收集前患者均未接受过手术治疗、化疗或放疗，且均通过病理学检查确诊为肺癌。排除标准：多发肿瘤，肿瘤原发病灶不能明确，其他器官肿瘤转移至肺部者。最终选取50例LUAD患者和50例LUSC患者纳入研究。本研究获得本院医学伦理委员会批准，且所有参与本研究患者均已签署知情同意书。

1.2UALCAN和GEPIA数据库差异表达基因分析 采用UALCAN(http://ualcan.path.uab.edu)和GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/)数据库分析TCGA数据库中LUAD和LUSC实体瘤和相对于癌旁正常组织中差异基因的表达情况，以改变倍数|log2FC|≥1，P<0.05为标准。

1.3组织RNA的提取与实时荧光定量PCR(qPCR)扩增 采用Trizol提取试剂盒(TaKaRa，大连宝生物工程有限公司)提取组织RNA，PrimeScriptTMRTⅡ反转录试剂盒(TaKaRa，大连宝生物工程有限公司)将RNA反转录为cDNA。通过Primer-blast对CALML3和GADPH进行在线引物设计。CALML3正向：5′-TGGATGAGCAGGGGATGAGA-3′，反向：5′-GCTGCCAGCGTATCCATTTG-3′；GADPH正向：5′-ACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，反向：5′-TGTTGCTGTAGCCAAATTCGTT-3′。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。采用SYBR®Premix Ex TaqⅡ试剂盒(TaKaRa，大连宝生物工程有限公司)进行PCR扩增，反应总体积20 μL，反应条件：预变性95 ℃ 30 s后，进行40个循环反应(95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s)。应用ABI 7500 Fast Real-time PCR扩增仪检测每个扩增循环后SYBR®Green荧光信号水平，运用溶解曲线检测扩增产物纯度。采用相对定量2-ΔΔCt的方法计算CALML3 mRNA的相对表达水平。

2 结 果

2.1CALML3在LUAD和LUSC中的表达情况 通过使用UALCAN数据库对TCGA数据进行统计分析，发现CALML3在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等多种类型的实体瘤中表达降低，而在LUAD、LUSC及宫颈鳞状细胞癌等肿瘤中表达升高。CALML3在LUSC组织中相对表达水平为436.059(105.149，904.051)，明显高于癌旁正常组织[0.447(0.143，0.810)]，约为癌旁正常组织的975倍(P<0.05)，见图1A。CALML3在LUAD组织中相对表达水平为0.061(0.000，0.175)，是癌旁正常组织[0.032(0.000，0.093)]的1.9倍(P=0.003)，见图1B。与相对应癌旁正常组织相比，CALML3在LUSC中的改变倍数是在LUAD中的7 149倍。由于设定小于改变倍数阈值(|log2FC|≥1)，即改变倍数≥2具有差异，而CALML3在LUAD组织中的相对表达水平仅为癌旁正常组织的1.9倍，因此CALML3在LUAD组织中的相对表达水平相对于癌旁正常组织没有明显的改变。

注：A为CALML3在LUSC中的表达情况；B为CALML3在LUAD中的表达情况。

为了进一步确认CALML3在LUAD和LUSC中的表达情况，采用GEPIA对TCGA数据进行提取分析，发现与癌旁正常组织相比，CALML3在LUSC组织中表达明显升高，而在LUAD组织中表达无明显差异，与UALCAN分析结果一致，见图2。

图2 CALML3在LUAD和LUSC中的表达情况

2.2CALML3与LUSC、LUAD的临床特征分析 LUSC患者性别、年龄、吸烟情况、肿瘤分期及淋巴结转移程度对CALML3的相对表达水平没有影响(P>0.05)。CALML3在61～80岁的LUAD患者中相对表达水平[0.061(0.000，0.175)]高于21～40岁的LUAD患者[0.041(0.036，0.046)]，差异有统计学意义(P=0.003)。此外，LUAD患者的淋巴结转移程度对CALML3的相对表达水平有影响(P<0.05)，然而肿瘤分期、性别和吸烟情况对CALML3的相对表达水平没有影响(P>0.05)。

2.3CALML3与LUSC、LUAD患者生存情况的相关性分析 CALML3与LUSC、LUAD患者总体生存期(OS)和无病生存期(DFS)不具有相关性(P>0.05)。

2.4CALML3对LUSC和LUAD的鉴别作用 CALML3在LUSC组织中的相对表达水平明显高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3A。CALML3在LUAD组织中的相对表达水平高于癌旁正常组织，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3B。CALML3在LUAD组织中的相对表达水平明显低于LUSC组织(LUSC/LUAD=3.653)。

注：A为CALML3在LUSC组织中的表达情况；B为CALML3在LUAD组织中的表达情况。

2.5CALML3对LUSC和LUAD的诊断价值 以LUAD为对照，CALML3诊断LUSC的受试者工作特征(ROC)曲线下面积(AUC)为0.837，95%CI：0.753～0.922，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4。当最佳临界值为2.155时，其灵敏度为0.720(95%CI：0.575～0.838)，特异度为0.860(95%CI：0.733～0.942)。见图4。

图4 CALML3鉴别诊断LUSC和LUAD的ROC曲线

3 讨 论

肺癌的主要病理类型为LUAD和LUSC，然而它们的分子生物学特征、治疗方法和治疗结果存在很大差异，因为其靶向治疗取决于组织学的精准分型，因此准确判断非小细胞肺癌患者的分型，对患者靶向治疗方案的确定至关重要[7]。

有研究发现，桥粒芯蛋白3和桥粒胶连蛋白3为潜在的LUSC生物标志物[7]。虽然其在鉴别诊断非小细胞肺癌上具有一定的优势，但仍有许多确诊的肺癌病例对LUAD和LUSC标志物呈双阳性现象[7]。因此，寻找更为准确且能够完全有效区分LUAD和LUSC的分子诊断标志物，对于LUAD和LUSC的鉴别和治疗尤为重要。

CALML3是一种钙依赖性细胞黏附分子跨膜糖蛋白编码基因，其作为肌球蛋白10的调节剂，能够与肌球蛋白10竞争性结合，对细胞黏附和运动起重要调控作用。CALML3已被证实可作为乳腺癌、胃癌、肝细胞癌的新型生物标志物和治疗靶点[6,8]。然而，CALML3在肺癌中的表达情况知之甚少。为了明确CALML3在肿瘤中的表达情况，本研究通过UALCAN 和GEPIA两大数据库对TCGA数据提取分析，发现CALML3在乳腺癌、肝癌、胰腺癌等肿瘤中表达降低，而在LUSC及宫颈鳞状细胞癌等肿瘤中表达升高，这说明CALML3在肺癌发生发展进程中起着癌基因的作用。

CALML3与肿瘤的侵袭转移相关[8]。CALML3作为肝癌的抑制剂可在体外和体内抑制肝癌的癌变和转移进程的激活，同时高表达的CALML3对肝癌生长和肺转移有明显的抑制作用[8]。本研究对CALML3在LUSC和LUAD中的表达水平与临床特征进行分析，发现LUSC患者的性别、年龄、吸烟情况、肿瘤分期及淋巴结转移程度对CALML3的相对表达水平没有影响，而LUAD患者的年龄、淋巴结转移程度对CALML3的相对表达水平有影响。但其具体机制尚不清楚，后续将深入探究。

CALML3除了参与肿瘤侵袭转移进程外，还与肿瘤预后明显相关。LIANG等[9]发现低表达的CALML3与CALML3甲基化及胃癌患者OS呈正相关。LI等[10]对基于TCGA的RNA测序和甲基化数据进行综合分析并建立肝癌预后风险模型，同样发现CALML3甲基化程度和表达水平与肝癌患者预后具有相关性。为了明确CALML3表达水平是否与肺癌患者预后具有相关性，本研究采用GEPIA数据库分析发现CALML3与LUSC、LUAD患者的OS和DFS不具有相关性。

CALML3在LUSC和LUAD中的鉴别作用报道极少，且其在肺癌中的表达和功能更鲜为人知。ZHAN等[3]通过对TCGA数据库中的RNA测序数据进行分析发现，CALML3在LUSC中表达水平改变倍数相当于LUAD的71.17倍，且CALML3鉴别LUSC和LUAD的AUC为0.964。随后ZHAN等[3]进一步通过免疫组化染色对CALML3进行分析发现，CALML3在LUSC和LUAD中的表达分布明显不同，CALML3鉴别LUSC、LUAD的灵敏度和特异度分别为90%和98%。为了进一步验证CALML3在LUSC和LUAD中的表达情况，以及CALML3对LUSC和LUAD的鉴别作用，本研究通过qPCR对LUSC和LUAD组织中的CALML3 mRNA进行检测发现，CALML3在LUSC组织和LUAD组织中的相对表达水平高于其癌旁正常组织，且CALML3在LUSC组织中的相对表达水平改变倍数是LUAD组织的3.653倍。此外，本研究发现CALML3在LUSC中的AUC为0.837，灵敏度为0.720，特异度为0.860，其能够作为鉴别LUSC和LUAD的潜在生物标志物。

综上所述，CALML3可作为鉴别LUSC和LUAD的一个潜在的生物标志物，但其在肺癌中的表达、功能及临床实用价值有待进一步研究。后期也将继续研究CALML3在肺癌患者血液及其他体液中的潜在价值，以明确CALML3的实际临床应用，以及能否作为一个无创的生物标志物用于肺癌亚型的鉴别诊断。