LC-MS/MS法和HPLC法检测人血清中利培酮和九羟利培酮血药浓度的对比研究*

邓顺顺，梁国朝，高永双

广东省中山市第三人民医院检验科，广东中山 528400

血药浓度受患者基因多态性、并发疾病、肝肾功能改变、药物剂型、药物相互作用及高蛋白饮食等众多因素的影响，从而使得常规用药可能导致不同患者出现不同的临床疗效[1]。治疗药物监测是针对不同患者个体，针对性制订给药方案的一种有效方法[2]。非典型抗精神病药物利培酮是目前临床广泛使用的一线治疗药物，化学结构属于苯并异噁唑类衍生物，是5-羟色胺的选择性拮抗剂和多巴胺D2受体[3-5]。对于首发精神分裂症患者仍多选择药物治疗，其中氯氮平、利培酮、阿立哌唑均是比较常见的药物[6]。精神分裂症的患者需要长期使用药物维持治疗，以减轻精神症状，控制疾病发作[7]。抗精神病药物引起的血糖、血脂代谢紊乱，是心脑血管疾病、糖尿病等多种疾病潜在的生物学危险因素[8]。利培酮在肝脏经9-羟基化、N-去甲基化等途径代谢，主要代谢产物为九羟利培酮，与利培酮具有相同的活性[9]。九羟利培酮血浆消除半衰期较长，对服用利培酮的患者进行治疗药物监测时，需要同时检测利培酮和九羟利培酮。因此，同时检测利培酮与九羟利培酮能准确反映疗效和不良反应发生率[10]。

本研究对本实验室同时开展的液质联用质谱(LC-MS/MS)法和高效液相色谱(HPLC)法检测利培酮和九羟利培酮血药浓度进行性能验证，在验证合格的基础上进一步对比LC-MS/MS和HPLC两种方法的检测结果，以观察结果的差异性，确定实验室检测方案。

1 材料与方法

1.1仪器与试剂 岛津LCMS-8040三重四级杆液质联用质谱仪，Agilent-1200高效液相色谱分析仪，Eppendorf-5424R台式低温高速离心机，Eppendorf移液枪，上海安亭低速离心机，上海医大涡旋混合器，帕恩特-XYB-H普通分析级纯水机，昆山KQ-300DV超声波清洗器，德国塞多利斯BT25S十万分之一分析天平，常熟百灵LP1002型1/100电子天平，中科美菱DW-HL218超低温冰箱。LC-MS/MS法检测试剂：水相、有机相、内标母液、稀释剂1、标准曲线试剂均购自深圳品生公司。HPLC法检测试剂：利培酮购自西安杨森制药有限公司，9-羟利培酮、曲唑酮购自美国SIGMA公司，甲醇、乙腈(色谱纯)购自德国默克公司，水为去离子水。

1.2方法

1.2.1血液标本处理 静脉血5 mL室温凝固后以4 000 r/min离心5 min，分离出的上清液为血清标本，进行第一次检测之后，将剩余的血清标本吸取约1.5 mL保存到小型离心管中，-20 ℃冰箱保存。将冻存于-20 ℃冰箱的标本拿出，放置于室温，复融后开始检测，每个标本只复融一次，避免反复冻融可能影响检测结果。

1.2.2色谱与质谱条件 LC-MS/MS法：预柱(Phenomenex，Security Guard Ultra Cartridges，AJ0-8775)，色谱柱(Phenomenex，Kinetex XB-C18，2.6 μm，3 mm×50 mm)；二元高压梯度洗脱，流速为0.4 mL/min；柱温45 ℃；进样量5 μL，采用电喷雾电离化(ESI)，正离子模式，加热模块温度为450 ℃，脱溶剂管温度200 ℃，喷气压力为230 kPa，流速20.0 L/min；采用多反应监测模式扫描。HPLC法：色谱柱为Eclipse Plus C18柱(150.0 mm×4.6 mm，3.5 μm，美国Agilent)，流动相(甲醇∶乙腈∶水为1.5∶1.7∶6.2)；每100 mL流动相中加入0.85 mL正丁胺，0.85 mL冰乙酸；流速为1.0 mL/min。

1.2.3稳定性试验 用质控血清标本(低、中、高3个浓度)各3份，检测其在-20 ℃ 保存1、14、31 d的稳定性。

1.2.4批内精密度 在同一天内，使用低、中、高3个浓度的标本分别进行5次独立测试。

1.2.5批间精密度 使用低、中、高3个浓度标本，每天分别进行5次独立测试，检测3 d，共获得45个测试数据。

1.2.6线性范围验证试验 配制8个已知浓度的标准品，在1个分析批内，对每个浓度点重复检测2次，进行线性回归分析，评价峰面积比值与浓度之间的线性关系，并计算检测浓度与已知浓度的偏差。

1.2.7提取回收率试验 在空白血清标本中加入不同体积标准溶液(标准溶液体积应少于总体积的10%)，制备3个浓度的标本(标本终浓度在测量区间内)。每个标本重复检测3次计算均值浓度、回收率。

1.2.8比对试验 用LC-MS/MS法和HPLC法检测同一例患者血清标本，并对检测结果进行比较分析。分段收取本院住院患者常规检测利培酮和九羟利培酮血药浓度标本共60份。每份标本当天检测一次并发放报告，将剩余血清吸出，置于1.5 mL小型离心管中，保存在-20 ℃冰箱中，30 d内用另一种方法检测，对两种方法检测出的相同标本的结果进行比较分析。

2 结 果

2.1性能试验验证结果 质控品在-20 ℃保存1、14、31 d的条件下，相对标准偏差均<15%，结果稳定。

LC-MS/MS法：利培酮低、中、高浓度(20、100、160 ng/mL)血清标本的提取回收率分别为105.72%、102.06%，101.27%；九羟利培酮低、中、高浓度(100、500、800 ng/mL)血清标本的提取回收率分别为92.06%、95.17%，102.29%。利培酮的线性范围为1.07～203.23 ng/mL，九羟利培酮的线性范围为5.60～1 033.34 ng/mL，最大允许偏差均<15%，r2均≥0.99。

HPLC法：利培酮低、中、高浓度(4、16、48 ng/mL)血清标本的提取回收率分别为110.0%、91.9%，107.5%；九羟利培酮低、中、高浓度(10、40、120 ng/mL)血清标本的提取回收率分别为90.0%、104.0%，110.3%。利培酮的线性范围为2.52～57.65 ng/mL，九羟利培酮的线性范围为5.39～141.23 ng/mL，r2均≥0.99。

两种方法的批内、批间变异系数均<15%，精密度良好。性能验证试验均通过。

2.2利培酮/九羟利培酮HPLC法与LC-MS/MS法检测结果比较 Shapiro-Wilk法显示LC-MS/MS法与HPLC法检测结果均呈正态分布。Pearson相关分析结果显示利培酮HPLC法与LC-MS/MS法结果呈正相关(r=0.984，P<0.05)，九羟利培酮HPLC法与LC-MS/MS法结果也呈正相关(r=0.949，P<0.05)。检测结果比较见表1。以LC-MS/MS法检测结果为横坐标，HPLC法检测结果为纵坐标分别绘制的散点图见图1。

表1 利培酮/九羟利培酮HPLC法与LC-MS/MS法检测结果比较

注：A为检测利培酮结果的散点图；B为检测九羟利培酮结果的散点图。

2.3利培酮/九羟利培酮HPLC法与LC-MS/MS法检测结果的偏差图 根据Bland-Altman偏差图可以得知，LC-MS/MS法检测利培酮与九羟利培酮的结果分别比HPLC法检测结果高1.97 ng/mL和1.38 ng/mL，95%置信区间分别为-5.81～9.74、-10.28～11.66，见图2、3。

图2 LC-MS/MS法和HPLC法检测患者九羟利培酮浓度结果的Bland-Altman偏差图

图3 LC-MS/MS法和HPLC法检测患者利培酮浓度结果的Bland-Altman偏差图

3 讨 论

本研究LC-MS/MS法采用的是品生公司提供的操作方法和试剂，HPLC法采用的是自配试剂，两种方法检测利培酮与九羟利培酮均采用同位素内标法，通过测量内标物及被测组分的峰面积相对值来进行结果计算，经验证两种方法均能很好地应用于利培酮和九羟利培酮血药浓度的检测中。HPLC由储液罐、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检测器、记录仪和数据处理系统组成[12]。LC-MS/MS法是将HPLC与质谱分别作为分离系统和检测系统，待测试样在HPLC部分经过分离后，进入质谱部分，标本与流动相分离后，经离子源对标本进行离子化，按离子的质荷比分离，然后测量各种离子谱峰的强度，从而实现分析目的的一种分析方法[13]。所以LC-MS/MS法是集HPLC法的高分离效能与质谱的高鉴定性能于一体，灵敏度较传统的HPLC法高3～4个数量级，对研究对象有足够的灵敏度、选择性，能分析更多的物质，分析能力更好。

近几年，LC-MS/MS法不断发展，由于其具有高效的色谱分离和专属特异的质谱检测等优势而被广泛应用于生物标本的分析[14]。随着色谱分析技术越来越多地运用于临床检测当中，实验室类似设备越来越多，根据需求会开展不同或者同一项目，比对分析已经成为日常检测质量控制中的重要一环。依据《全国临床检验操作规程》要求实验室内采用不同方法或仪器检验的同一项目，应进行一致性比较，定期实施比对(至少每年一次)及时解决比对试验中出现的问题，并保留记录[15]。LC-MS/MS检测设备灵敏度和特异度均高于HPLC检测设备，运用前景良好，但设备价格昂贵，对于检测量不高的项目很多还是需要用到价格相对便宜的HPLC设备进行检测。实验室制订好规章制度，按要求做好比对试验，做好详细记录，在性能验证和比对验证合格之后，若一台设备出现故障维修或需要维修保养期间，可以及时启用另一台设备开展相关检测，充分提高设备检测利用率，提高检测时效。两种方法均可用于日常检测，但两者检测结果存在差异，如果是需要长期监测的患者建议一直选用同一种方法检测。