西瓜根际土壤解磷芽孢杆菌的筛选及其解磷特性研究

汪金华，杨腊英，黄俊生，周 游，汪 军，郭立佳

（1.海南大学植物保护学院，海南 海口 570228；2.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所/农业部热带作物有害生物综合治理重点实验室/海南省热带农业有害生物监测与控制重点实验室，海南 海口 571101）

磷在提高植物光合作用，促进根系发育和维持能量循环中起着重要的作用，它是植物生长中不可缺少的营养元素［1-2］.我国土壤中含有较为丰富的磷资源，但其中大部分都以难溶性的磷灰石、氧磷灰石、羟基磷灰石、磷酸二酯、磷酸三酯等矿石或有机物的形式存在，只有不超过5%的可溶性磷能被植物吸收和利用［3-4］.因此，为了满足作物生长所需要的磷，向土壤施加磷肥成了一种可行的方式；然而，向土壤施肥虽然也能提高作物产量，但是不科学的施肥方法往往也会破坏土壤结构，导致环境污染，甚至使水体富营养化［5］.此外，由于磷肥在土壤里容易被固定，其平均利用率只有10%～20%，因此易造成磷资源的浪费［6］.土壤里有一类微生物可以分解土壤中难溶性的矿质磷，它们被称为解磷微生物，解磷微生物可以通过分泌磷酸酶和有机酸，比如柠檬酸、葡萄糖酸、依康酸、苹果酸和草酸等来促进磷元素从磷的化合物里释放出来［7-8］，从而使其成为可被植物吸收和利用的游离态磷.土壤中的解磷微生物有很多，其中细菌占大部分比例［9］，据估计，土壤中大约有50%的细菌被认为是解磷细菌，解磷细菌的种类比较多，包括芽孢杆菌（Bacillus）、假单胞菌（Pseudomonas）、肠杆菌（Enterobacter）、节杆菌（Arthrobacter）、克吕沃尔氏菌（Kluy⁃vera）、金色单胞菌（Chryseomonas）、弧菌（Vibrio）、黄色杆菌（Xanthobacter）、微球菌（Micrococcus）、克雷伯氏菌（Klebsiella）等多种属中的一种或几种细菌［10］，并且，不同种类的解磷细菌也会通过不同的机制来分解不同来源的磷.解磷菌的数量和分布在很大程度上受土壤结构类型、质地、土壤有机质和耕作方式的影响.相关研究表明，植物根际土中解磷菌的种类和数量比非根际土中解磷菌的种类和数量要多很多［11］.赵小蓉［12］等的研究发现，玉米根际土中细菌和解磷菌的数量要远大于非根际土中细菌和解磷菌的数量.Katznelson发现小麦根面的解磷菌数量比根际和非根际中的解磷菌数量多十几倍，并且在大麦、红三叶等植物的根际土微生物数量更高，但在不同作物根际，解磷菌的数量和种类也是不同的［13］.目前，对解磷菌的研究主要集中在高效解磷菌的筛选和对解磷特征的分析上.将用解磷微生物加工成的菌肥施入土壤中，一方面可以提高土壤肥力，保证植物生长和改善土壤的菌群结构，另一方面又可以减少磷肥的使用，从而节约肥料资源，减少污染.可见，解磷细菌的研究对土壤磷素的转换过程有着重要的意义，也对未来农业的可持续发展起着十分重要的作用.

目前，可防控各种土传病害的和含高效拮抗生防菌的生物菌肥的研发已经成为一个热点，其中，包括香蕉枯萎病拮抗生防菌与香蕉根结线虫拮抗菌淡紫拟青霉结合研发的复合微生物菌肥［14］.鉴于此，为拓宽生物菌肥的功效，将香蕉枯萎病、番茄青枯病、柑橘黄龙病的拮抗生防菌与提高肥效利用率的菌株相结合，并以此来研发不同系列的微生物菌肥，同时通过平板溶磷圈法和钼锑抗比色法筛选出了一株具有较强解磷性能的细菌，并进行了菌株的鉴定与溶磷条件的分析，旨在为后续的研发打下良好基础.

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1土样实验土样来自甘肃省白银市的一块西瓜地，其地理位置为东经103'—105'，北纬35'—37'.

1.1.2培养基无机磷固体培养基：葡萄糖（C6H12O6）10 g，硫酸铵（（NH4）2SO4）1 g，磷酸钙（Ca3（PO4）2）5 g，琼脂16 g，蒸馏水1 000 mL.

无机磷液体培养基：葡萄糖（C6H12O6）10 g，硫酸铵（（NH4）2SO4）1 g，磷酸钙（Ca3（PO4）2）5 g，硫酸镁（Mg SO4）0.1 g，胰蛋白胨0.5 g，琼脂16 g，蒸馏水1 000 mL，pH调至7.0.

LB液体培养基（解磷细菌的富集）：氯化钠10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，蒸馏水1 000 mL.

LB固体培养基（单菌落形态的观察）：氯化钠10 g，胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1 000 mL.

1.1.3其他溶液钼酸盐溶液：将13 g钼酸铵（（NH4）6Mo7O24·4H2O）溶于100 mL蒸馏水中，接着将0.35 g酒石酸锑钾（KSbC4H4O7·1H2O）溶于100 mL蒸馏水中，在不断搅拌的情况下，将钼酸铵溶液徐徐加入到300 mLφ=50%的硫酸溶液中，然后再加入酒石酸锑钾溶液，混匀，以棕色瓶于4℃保存.

w=10%的抗坏血酸溶液：将10 g抗坏血酸溶于100 mL的蒸馏水中，并以棕色瓶于4℃保存.

芽孢染色剂：φ=5%的孔雀绿水溶液，φ=0.5%的番红水溶液.

1.2方法

1.2.1菌株的筛选（1）解磷菌的提取和初筛：将西瓜苗根部土壤抖落收集，取1 g土样，并将其置于已灭菌的三角瓶中，加入50 mL的无菌水，放入30℃的摇床中以180 r/min震荡20 min后取出，然后将震荡后的样品逐级稀释成10-5、10-6、10-7的悬浊液.分别吸取100μL不同质量浓度的悬浊液，将其加到无机磷固体培养基上，用玻璃棒涂抹均匀，每个质量浓度重复3次.7 d后测量无机磷固体培养基上有透明圈的菌体直径（d）和透明圈的直径（D），并计算D/d.

（2）解磷菌的富集和复筛：取两只100 mL的三角瓶，各装入50 mL的LB液体培养基，挑出无机磷固体培养基上解磷能力较强的菌株并将其接种于LB液体培养基中，摇床培养48 h（温度37℃，转速180 r/min）.将培养液取出并于无菌离心管中离心，重新用无菌水悬浮菌体.将菌悬液各取1 mL并将其接种到50 mL的无机磷液体培养基中，摇床培养3 d（对照组接入100μL的无菌水）.3 d后离心并取上清液.最后参考陈玮［15］改编的钼锑抗比色法，测定速效磷的含量，同时选出速效磷高的菌株.

1.2.2菌株的鉴定（1）菌株形态和生理生化鉴定：在LB固体培养基上用平板划线对菌株进行纯化，而后观察菌株单菌落的形态.根据沈萍［16］的方法对细菌进行芽孢染色；同时参考赵斌［17］的方法，对菌株进行唯一碳源试验，淀粉、纤维素分解试验，明胶液化试验，硝酸盐还原试验.

（2）分子生物学鉴定：根据迟原龙等［18］的碱裂解法提取细菌DNA，使用细菌通用引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3′）进行PCR序列扩增.扩增程序为：94℃预变性4 min；95℃45 s，55℃45 s，72℃60 s，30个循环；72℃延伸10 min，PCR产物送至上海生工测序，然后将测序所得序列在Gene Bank数据库中进行BLAST比对，并通过MEGA6.06软件对解磷菌株构建系统发育进化树.

1.2.3培养时间与溶液中速效磷的关系配制无机磷液体培养基，取1 mL菌悬液并将其置于50 mL灭过菌的无机磷液体培养基中，作为处理组，处理组制成相同7份，以不加菌液的培养基作为对照组.接菌后于温度为37℃和转速为180 r/min的摇床中培养.以后1～7 d每天取1份处理组，并以钼锑抗比色法测量其中速效磷的含量，同时测量每天的pH，取3次重复的平均值.

1.2.4初始接种量与溶液中速效磷的关系配制无机磷液体培养基，灭菌后分别接0 mL、0.5 mL、1 mL、2 mL、3 mL、4 mL的菌悬液（稠密度为2×107CFU/mL）于50 mL的液体培养基中，接着将其置于转速为180 r/min和温度为37℃的摇床中.第3天取出，测量其pH以及其中的速效磷含量，取3次重复的平均值.

1.2.5初始pH与溶液中速效磷的关系用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH将无机磷液体培养基分别调成pH为5、6、7、8、9的培养基，于121℃灭菌20 min后，接入稠密度为2×107CFU/mL的4 mL菌悬液，并于180 r/min和37℃的条件下培养3 d.3 d后取出，测量其速效磷的含量和pH值，取3次重复的平均值.

2 结果与分析

2.1菌株的分离与筛选通过对土壤样品的涂布处理，在无机磷固体培养基上出现了7株有透明圈的菌落，通过比较菌落透明圈直径（D）和菌落直径（d）之比（表1），筛选出了两株解磷能力较强的菌株（图1）.每个菌落的透明圈直径和菌落直径均量取3次，均取平均值.其中，菌株1的透明圈的平均直径为1.03 cm，菌落平均直径为0.33 cm，透明圈直径与菌落直径之比的平均值为3.11.菌株2的透明圈直径与菌落直径之比的平均值为1.79，两株菌株的解磷能力均强于其他菌株，故对菌株1、2的解磷能力再进行比较.

表1 菌株在无机磷平板上的透明圈（D）和菌落直径（d）之比

图1 解磷细菌在无机磷固体培养基上的解磷情况

2.2菌株的复筛两株菌株在无机磷液体培养基中培养3 d后，利用钼锑抗比色法测量菌液中速效磷的含量，试验结果如表2所示，由表2可知，在菌株1的培养液中，其速效磷的含量最高，可达100 mg/L，大于菌株2的速效磷含量，也远大于对照组的4 mg/L，在此将菌株1命名为GS032，并对其进行进一步的生理生化和分子鉴定.

表2 两菌株发酵液中可溶性磷的含量

2.3菌株的形态和生理生化特征菌落呈淡黄色不透明状，为不规则形状，菌落表面开始较为湿润、平滑和不粘稠，后期干燥有褶皱.在芽孢染色后，于油镜镜检下发现有绿色的芽孢，如图2所示.该菌株能利用葡萄糖、果糖等多种糖类，也能分解淀粉，但不能分解纤维素，其生理生化的鉴定结果如表3所示.

表3 生理生化的试验结果

图2 菌株GS032于芽孢染色后的显微观察结果

2.4菌株的分子生物学特征将所测得的生物序列放入GenBanK中进行BLAST比对，选择同源性最高的12条完整序列，在MEGA6中分析和比对序列后，采用邻位法构建生物系统发育树（图3）.由图3可知，与GS032序列同源性最高的是序列MT372156.1，能达到99.86%.已向GenBank提交序列数据，并获得核苷酸序列登录号MW276036.

图3 菌株GS032的系统发育树

2.5培养时间与溶液中速效磷的关系由图4分析可得，从第1天到第5天，随着解磷菌培养时间的延长，培养基内的速效磷含量先上升后下降.在第3天时达到最高含量（87.2 mg/L），第3天后开始下降，第5天时培养基内的速效磷含量最低，只有41.8 mg/L，比第3天少45.4 mg/L，是第3天速效磷含量的一半.与之相反的是，培养基内的pH则呈现先下降后上升的趋势，第3天时最低，而第5天时最高.从第1天到第7天，培养基内pH值升高时，速效磷的含量则下降，而pH值下降时速效磷的含量却升高，这说明解磷菌分泌出的有机酸溶解了部分磷酸钙.

图4 不同培养时间下培养基的速效磷含量及其培养液的pH变化

2.6初始接种量与溶液中速效磷的关系由图5可得，解磷菌接种量对培养基内速效磷含量的促增效果是极显著的（P<0.01），随着接种量的增加，培养基内速效磷的含量也在不断增加，菌液接种量为4 mL时培养基内速效磷的含量为115.04 mg/L，比接种量为0.5 mL时要高出76.2%.0.5 mL的处理与2 mL、3 mL、4 mL的处理相比较，其速效磷含量的差异显著，但与1 mL的处理相比较，其速效磷含量的差异则不显著.1 mL的处理与3 mL、4 mL的处理差异显著，但与0.5 mL和2 mL处理的差异不显著.处理间速效磷含量差异最显著的是0.5 mL和4 mL处理，由此可见，接种量差异越大，速效磷含量的差异也就越显著.与CK组相比，处理组的pH都有了明显的下降，除了对照组，接了菌的培养基都呈酸性，0.5 mL处理的pH最高，2 mL处理的pH最低.并且，在培养时间相同的条件下接种量越大，培养基中速效磷的质量浓度也就越高.

图5 菌株GS032在不同初始接种量下摇培后的速效磷含量及pH的变化（条形图上的不同小写字母代表差异显著性，P<0.05）

2.7初始p H值与溶液中速效磷的关系据图6分析可得，培养基的初始pH值对培养基内速效磷含量的促增效果是显著的（P<0.05）.培养基内pH从5到9依次升高时，培养基内的速效磷质量浓度则在逐步降低，pH为8和9时培养基内速效磷的含量相差很小.初始pH为5时，培养基中速效磷质量浓度最高，可达224 mg/L.pH为8时速效磷的质量浓度最低，比最高质量浓度低40.5%.在初始pH同为酸性或者同为碱性时，溶液中速效磷的含量差异不显著，如初始pH为7、8、9时，他们之间速效磷的含量差异不显著.培养基初始状态为酸性和碱性相比，最终的速效磷含量差异是显著的.除初始pH为5的处理外，其他处理的最终pH较初始pH都有一定的下降，初始pH越高，最终pH也就越高.

图6 菌株GS032在不同初始pH条件下于摇培后溶液中的速效磷含量及pH的变化（条形图上的不同小写字母代表差异显著性，P<0.05）

3 讨论与结论

由于农业需要来自磷矿的磷，而磷矿是一种不可再生的资源，加之剩余磷矿的质量在下降，磷肥的生产成本也较高，因此分解和活化土壤中的矿质磷就成为缓解磷素危机的一条重要途径［19-20］.细菌、真菌和放线菌是主要的三种解磷菌，其中，细菌的种类最多，真菌的解磷能力更强，而放线菌则是耐热性更强［21-22］.本实验分离和筛选出了一株有解磷能力的菌株.在培养过程中，培养液的pH下降，培养基里速效磷的含量则升高.根据秦利均［23］的整理分析和Bolan［24］的实验表明，解磷菌是分别通过磷酸酶和小分子有机酸来分解有机磷和无机磷的，并且有机酸主要是通过减少磷的吸附和增加磷化合物的溶解来提高土壤中磷的有效性的.在解磷菌的培养过程中，培养基内速效磷的含量先上升，在第3天时达到最高，而后又下降.杜雷［25］的研究表明，在低磷胁迫下，解磷菌能更好地发挥其功能，磷质量浓度过高，解磷菌的促进作用亦会减弱.这和本实验的结果是一致的，第3天时速效磷的质量浓度升高到了一定程度，解磷菌的解磷速度减弱，再加上解磷菌本身的消耗亦会导致培养基内速效磷的含量降低.当磷质量浓度降低到一定程度后，在低磷胁迫下，解磷菌又开始进行下一轮的分解工作.经过多年的研究，相关课题组已经研发出一系列含高效拮抗生防菌的防控土传病害的生物菌肥，并且为了增加生物菌肥的菌株功效，研究者们还将枯萎病、青枯病，黄龙病等的生防拮抗菌与能提高肥料利用率的解磷菌相结合，研发出了多功效的生物菌肥.可见，解磷菌的筛选和功能研究对多功效复合微生物菌肥的研发有着重要的参考价值.

本研究通过平板溶磷圈法和钼锑抗比色法，从甘肃的一块西瓜地里分离和筛选出了一株有解磷能力的菌株.经生理生化实验、芽孢染色和16SrDNA基因序列测序后，该解磷菌株被鉴定为枯草芽孢杆菌.该菌株能利用葡萄糖、蔗糖等，但不能分解和利用纤维素.在培养过程中，菌株产生了酸性物质，能分解磷酸钙并能使培养基里的速效磷含量升高，随着培养基里的细菌数量增加，其吸收了培养液里的可溶性磷，从而使得培养液里的速效磷含量下降.实验表明，至少在短期内，培养液接入的解磷菌数和培养液初始pH与后期培养液内的速效磷含量有着明显的相关性，因此研究解磷菌的解磷特征对研究土壤中的磷循环有着重要的意义.