基于微阵列和生物信息学分析的茯苓多糖对Lewis肺癌小鼠差异表达miRNA的影响

张旭裕，钟诚，蒲有为，杨中伟，鲍依稀

重庆医科大学附属第二医院，重庆 400010

肺癌是世界范围内发病率最高的癌症之一[1]。肺癌在男性中发病率居世界首位，仅次于女性乳腺癌的发病率[2]。目前除手术外，放疗、化疗和靶向治疗也是肺癌患者的常见治疗方法[3]。然而，这些疗法常伴有严重不良反应，严重影响患者的生活质量。研究发现，中药多糖具有抗肿瘤、抗氧化和免疫调节的作用[4-8]。其中，茯苓多糖（Poria polysaccharide）具有多种生物活性，包括免疫调节及抗肿瘤作用[9-11]，但其机制尚未阐明。

microRNAs（miRNAs）是一类小的单链、进化保守的非蛋白质编码RNA，在调控基因表达、细胞周期、生物发育时序等方面起重要作用[12]。miRNA微阵列技术具有灵敏度高、特异性强、线性范围宽等优点，使用通用的实时定量反应条件进行高通量miRNA表达谱分析，检测miRNA表达谱改变对于破译差异表达基因的生物学背景极其重要。本研究通过miRNA微阵列技术，寻找茯苓多糖干预后小鼠脾脏免疫相关miRNA差异并预测靶点基因，探索关键基因的生物学功能和信号通路，为茯苓多糖的免疫治疗提供依据。

1 实验材料

1.1 动物

C57BL/6雌性小鼠10只，4～6周龄，体质量18～22 g，购自重庆医科大学实验动物中心，动物许可证号SYXK（渝）2018-0003。饲养于重庆医科大学实验动物中心SPF级动物房，温度（23±1）℃，相对湿度40%～70%，12 h光照，自由摄食饮水。

1.2 药物

茯苓，购自重庆万鑫药房连锁有限公司，批号20191008，由重庆医科大学中药学院王刚教授鉴定为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos（Schw.）Wolf的干燥菌核。

1.3 主要试剂与仪器

TriPure分离试剂（货号11667157001）、DNA酶（货号M0303S）、All-in-OneTMmiRNA第一链cDNA合成试剂盒（货号QP013）、All-in-OneTMqPCR混合液（货号QP001）、All-in-OneTMqPCR引物，美国GeneCopoeia公司。Light cycler480ⅡRT-PCR System（瑞士Roche公司），UV-NanoDrop®8000分光光度计（美国Thermo公司），TP650普通PCR仪（日本Takara公司），5810R高速冷冻离心机（德国Eppendorf公司），SHZ-Ⅲ旋转蒸发仪（中国Chongye公司），FD-1A-50真空冷冻干燥机（中国Bilon公司）。

2 实验方法

2.1 茯苓多糖制备

精确称取200 g茯苓于烧杯中，加入2 000 mL蒸馏水，80 ℃水浴提取2 h，过滤，重复2次，合并提取液，离心去沉淀，减压浓缩。冷却后加4倍体积无水乙醇，置于4 ℃冰箱中沉淀24 h。离心取沉淀，用少量蒸馏水溶解，加入1/5体积的sevag试剂（氯仿∶正丁醇＝4∶1），电动搅拌器快速搅拌10 min，4 000 r/min离心3 min，取上清液，不断重复除蛋白数次，直到除尽。取上清液在纯水中透析36～48 h，浓缩，冷冻干燥，即得茯苓多糖。

2.2 造模、分组及给药

Lewis肺癌细胞（LLC）由陆军军医大学第二附属医院方军教授提供。细胞用含10%胎牛血清、1%青链霉素的DMEM培养基置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。将LLC消化处理，配制成4.0×106个/mL细胞悬液，每只小鼠右腋皮下注射100 μL细胞悬液。将10只小鼠随机分为生理盐水组和茯苓多糖组，每组5只。待肿瘤体积增长至1 cm3后，生理盐水组予生理盐水灌胃，茯苓多糖组予茯苓多糖（200 mg/kg）药液灌胃。每日1次，连续灌胃4 d停1 d为1个周期，连续4个周期。观察小鼠精神状态，每2 d监测小鼠体质量及肿瘤体积。20 d后，脱颈处死小鼠，收集肿瘤、脾脏和胸腺组织称重，计算肿瘤抑制率[（1－茯苓多糖组平均肿瘤质量÷生理盐水组平均肿瘤质量）×100%]、脾脏指数[脾质量（g）÷体质量（g）×100%]、胸腺指数[胸腺质量（g）÷体质量（g）×100%]。

2.3 miRNA微阵列分析及靶标预测

取80～100 mg脾脏组织，加入液氮研磨至粉末状，转移至装有1 mL TriPure的1.5 mL离心管，振荡混匀后室温静置5 min。加入0.2 mL氯仿，振荡混匀15 s，室温静置3 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min。弃上清，空气干燥RNA沉淀约5 min，加入适量DEPC溶解RNA沉淀。分光光度计测定RNA浓度和纯度。配制1%TAE琼脂糖凝胶进行RNA电泳，检测RNA完整性。使用DNaseⅠ除去RNA样品中污染的基因组DNA，进行miRNA反转录。配制miRNA反转录反应液，短暂离心后37 ℃孵育1 h，85 ℃灭活处理5 min，用灭菌水稀释5倍，-20 ℃冰箱保存备用。PCR检测采用标准三步法，以20 μL反应体积进行qPCR引物阵列分析，每个阵列都是一组针对89个与肺癌免疫进展密切相关的经优化验证的qPCR引物。此外，MsnoRNA U6、MsnoRNA U68、MsnoRNA U70、MsnoRNA U49A、MsnoRNA U72和阴性对照均用作标准化表达结果的参考因子。

使用ΔΔCt方法对不同样品的基因进行相对定量。ΔΔCt＝AveΔCt（测试）－AveΔCt（对照）。2-ΔΔCt值是不同样品之间目标基因表达水平的差异倍数。通过GeneCopoeia在线数据分析系统（http://www.gene copoeia.com.cn/product/qpcr/analyse/）分析miRNA表达水平。使用生物信息学在线软件（http://www.bio informatics.com.cn/）进行聚类分析。筛选｜Fold change｜＞1.5的miRNA。使用TargetScan 7.1（http://www.targetscan.org/）、miRDB（http://mirdb.org/）、miRWalk（http://mirwalk.umm.uniheidelberg.de/）数据库预测各差异miRNA的靶点基因，并取交集汇总。

2.4 GO和KEGG富集分析

通过DAVID数据库（https://david.ncifcrf.gov/）对下游靶点基因进行GO功能及KEGG通路富集分析。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2.5 蛋白相互作用网络构建及关键基因分析

通过STRING数据库（http://string-db.org/）构建PPI网络，并使用Cytoscape 3.8.0软件进一步分析。使用CytoHubba模块通过不同排秩方法筛选Hub基因。

3 统计学方法

使用SPSS26.0统计软件进行分析。实验结果以±s表示，多组比较用方差分析，两两比较用t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 茯苓多糖对小鼠肿瘤和免疫器官指数的影响

与生理盐水组比较，茯苓多糖组小鼠脾脏指数、胸腺指数明显升高（P＜0.05），肿瘤质量明显减轻（P＜0.05），见表1，肿瘤抑制率为16.75%。肿瘤体积随时间变化趋势见图1。

表1 2组小鼠肿瘤质量和免疫器官指数比较（±s）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 只数 肿瘤质量/g 脾脏指数/% 胸腺指数/%生理盐水组 5 8.318 4±0.63 0.90±0.05 0.054±0.001茯苓多糖组 5 6.887 2±0.55* 1.11±0.09** 0.113±0.013**

图1 2组小鼠肿瘤体积随时间变化趋势（±s，每组5只）

4.2 差异miRNA筛选及靶标预测结果

根据miRNA表达结果确定茯苓多糖组和生理盐水组miRNA差异表达水平，见图2。筛选｜Fold change｜＞1.5的miRNA。与生理盐水组比较，茯苓多糖组有8个差异miRNA：mmu-miR-29b-3p、mmu-miR-139-5p、mmu-miR-21-5p、mmu-miR-18a-5p、mmu-miR-126-3p、mmu-miR-29a-3p、mmu-miR-451和mmu-miR-143-3p。此外，使用层次聚类法分析差异表达的miRNA，见图3。使用TargetScan、miRDB和miRWalk在线数据库预测8个差异miRNA的靶点mRNA。最终选择3个数据库的交集mRNA，见图4。

图2 2组小鼠miRNA倍数变化柱状图

图3 2组小鼠miRNA表达层次聚类分析

图4 TargetScan、miRDB和miRWalk数据库靶标基因韦恩图

4.3 GO和KEGG富集分析结果

GO分析发现，靶点基因参与多种生物过程（BP），如细胞生物过程、代谢过程、发育过程、生物调节和转录调控过程；一些基因与细胞成分（CC）的结构有关，如细胞质、细胞核、细胞骨架、细胞连接、蛋白质复合物和核质部分；涉及的分子功能（MF）有结合、催化活性、核酸结合和蛋白质结合功能。结果表明，茯苓多糖干预后可能引起细胞成分、生物过程和分子功能的改变。见图5。

图5 茯苓多糖调节Lewis肺癌小鼠脾脏免疫靶点基因GO分析

KEGG通路富集可用于评估有差异表达的信号转导和代谢途径。茯苓多糖组受影响的前33条主要通路（P＜0.01）见图6。富集度较高的途径包括癌症通路、癌症蛋白聚糖、PI3K-Akt、MAPK和Ras信号传导途径，这些途径可能与茯苓多糖治疗Lewis肺癌小鼠的免疫调节有关。

图6 茯苓多糖调节Lewis肺癌小鼠脾脏免疫靶点基因KEGG通路富集分析（P＜0.01）

4.4 蛋白相互作用网络构建及关键基因分析结果

关键基因是在生物过程中起重要作用的基因。在相关途径中，其他基因的调控通常受Hub基因影响。因此，Hub基因是重要的研究靶点。通过STRING数据库分析504个交集靶点基因，并使用Cytoscape 3.8.0绘制PPI网络，见图7。CytoHubba使用中介中心性（betweenness）排秩方法对前30个Hub基因进行分析，见图8。通过使用不同排秩方法分析前10个Hub基因，并取交集获得3个关键基因（Mapk8、Kras、Stat3），结果见表2。

表2 不同排秩方法的前10位Hub基因

图7 茯苓多糖调节Lewis肺癌小鼠脾脏免疫靶点基因PPI网络

图8 前30个Hub基因PPI网络

5 讨论

茯苓含多糖、脂肪酸、三萜类化合物、酶及固醇等生物活性成分，其中茯苓多糖具有免疫调节和抗肿瘤作用。为进一步分析茯苓多糖的免疫调节潜力，本研究通过miRNA微阵列和生物信息学技术筛选并分析差异表达miRNA，并进一步分析其作用和参与的不同信号传导途径。与生理盐水组比较，茯苓多糖组小鼠筛选出8种异常表达miRNA。前期研究表明，miR-29b-3p通过抑制COL1A1基因表达，上调PTEN和Bax蛋白表达，逆转A549/DDP细胞顺铂耐药性[13]。miR-139-5p在多种肿瘤组织中表达下调，并可作为潜在的肿瘤抑制因子发挥作用，已发现其表达与非小细胞肺癌（NSCLC）患者的肿瘤体积、临床分期、病理类型和淋巴结转移有关[14]。Huang等[15]研究显示，miR-139-5p过表达可明显抑制NSCLC细胞增殖。miR-126-3p在生长调节中起重要作用，且其水平在NSCLC组织和细胞中均显著下调[16]。相反，miR-451a可通过调节激活转录因子2活性抑制NSCLC细胞的迁移和侵袭能力[17]。本实验结果表明，茯苓多糖在改变小鼠miRNA表达方面发挥显著作用。

PI3K/Akt通路在多种生物活性物质信号转导中起重要作用。有研究表明，肿瘤相关巨噬细胞可通过PI3K/Akt信号通路对肺癌A549细胞产生作用[18]。miR-145通过调节EGFR/PI3K/Akt信号通路抑制NSCLC细胞迁移并诱导细胞凋亡[19]。Zhang等[20]研究表明，叶黄素通过抑制PI3K/Akt信号通路抑制细胞生长并激活细胞凋亡。miR-16可针对性地抑制MAPK激酶1调节信号转导途径，从而调节肺癌细胞增殖和侵袭[21]。

Stat3和Kras对NF-κB转录因子活性具有正向调控作用[22-23]，并参与细胞因子介导的信号通路[24]。此外，Kras参与Ras蛋白信号转导，并对MAPK活性有正调控。Stat3的其他生物过程包括对白细胞介素-6产生的正向调控，其受体通过JAK/STAT和Th17型免疫应答信号通路发挥作用。此外，Mapk8能应激激活MAPK级联反应，其生物过程涉及凋亡信号通路的正调控。

本研究利用差异基因预测出PI3K-Akt、MAPK和Ras 3个信号通路，成功构建了差异基因的PPI网络，并筛选出网络中可能参与免疫调节过程的3个关键基因（Stat3、Kras和Mapk8），表明其在茯苓多糖干预肺癌荷瘤小鼠中的关键作用。对该网络的进一步研究将有利于理解茯苓多糖的免疫调节作用机制。