基于纤维素膜吸附的黄瓜基因组DNA快速提取方法

薛强　王燕飞　盛万里　陈艳　金涌　邹明强

摘    要：为快速获取与鉴定黄瓜基因组DNA，建立一种基于纤维素膜吸附的黄瓜基因组DNA快速提取方法，以市售华北型黄瓜为材料，制备纤维素膜片，筛选黄瓜裂解试剂，优化提取反应条件，建立了包括黄瓜裂解、膜片吸附、膜片清洗、核酸洗脱等步骤的黄瓜基因组DNA提取方法，可以在5 min内从黄瓜果实中提取基因组DNA用于PCR扩增。黄瓜果实的表皮、表层果肉和中心果肉都可以实现基因组DNA提取和PCR扩增，最少可以从13 mg黄瓜果实中提取并检测到黄瓜管家基因Act1片断。利用膜吸附DNA提取技术实现了黄瓜基因组DNA的快速提取，为黄瓜基因研究与快速鉴定提供了一种简便方法。

关键词：黄瓜;膜吸附;基因组DNA提取

中图分类号：S642.2 文献标志码：A 文章编号：1673-2871（2021）10-039-05

A rapid extraction method of cucumber genomic DNA based on cellulose membrane adsorption

XUE Qiang1， WANG Yanfei2， SHENG Wanli3， CHEN Yan1， JIN Yong1， ZOU Mingqiang1

（1. Chinese Academy of Inspection and Quarantine， Beijing 100123， China; 2. Solid Waste and Chemicals Management Center， Ministry of Ecology and Environment of the People's Republic of China， Beijing 100029， China; 3. Technical Center of Hohhot Customs District， Hohhot 010020， Inner Mongolia， China）

Abstract： In order to quickly obtain and identify cucumber genomic DNA， a rapid extraction method of cucumber genome DNA based on cellulose membrane adsorption is established. After preparation of cellulose membrane， development of lysis reagents， optimization of extraction conditions， a method includes cucumber lysis， membrane adsorption， membrane cleaning and nucleic acid elution was established. Genomic DNA of cucumber fruit could be extracted in 5 min and directly used for PCR amplification. Genomic DNA could be extracted from cucumber fruit epithelium， surface flesh and central flesh. And house-keeping gene Act1 fragments can be amplified from the 13 mg of cucumber fruit. Cucumber genomic DNA could be extracted quickly by using membrane adsorption DNA technology. It provides an easy method to research and rapid identification of cucumber gene.

Key words： Cucumber;Membrane adsorption;DNA extraction

黃瓜是遍布世界的重要蔬菜，黄瓜基因组计划已经完成，基因组学研究方法正在如火如荼地展开，在抗病性、抗虫害、抗逆性、抗除草剂、品质改良等方面进行了多项研究[1]，在涉及黄瓜基因的众多研究与鉴定方法中，对黄瓜基因组DNA的检测鉴定是最常用到的试验方法。

在黄瓜DNA的检测鉴定中，首先要提取黄瓜基因组DNA，目前常用的提取方法是CTAB法[2]和SDS法[3]，都要以新鲜叶片为原材料，需要研磨和离心等步骤，费时费力，而且市售的黄瓜一般也不带有叶片，直接用黄瓜果实进行提取和鉴定更为便利。商品化试剂盒多采用硅膜吸附离心法与磁珠吸附法。应用硅膜吸附离心法，在高浓度超离液盐存在的情况下将黄瓜裂解后游离的基因组DNA与固体硅膜支撑物结合，然后通过一系列清洗和离心步骤去除杂质，最后在低浓度盐溶液中从硅膜洗脱核酸[4]。而磁珠吸附法是在磁珠表面进行官能团修饰[5-7]，实现与核酸吸附，然后利用磁铁吸附磁珠分离和去除杂质，最后将磁珠上的核酸洗脱[8]。2种方法都需要多个步骤，需要熟练的操作人员和配套的实验仪器设备。此外，纤维素膜吸附法也可以用于核酸的提取[9]，修饰后的纤维素膜可以从人血液里提取基因组DNA[10]，也可以在多种生物体里实现核酸快速提取[11]，还可以用于法医工作中DNA证物的长期保存[12]。膜吸附核酸提取法操作简便快速，不需要离心机、磁铁等辅助设备。DNA提取膜吸附法具有很大的应用潜力，但是目前还没有在黄瓜等蔬菜的基因组DNA提取中应用。笔者自2020年6—12月，在中国检验检疫科学研究院快速检测技术实验室从裂解液开发、试验步骤、试验条件等方面进行研究，建立了黄瓜基因组的膜吸附快速提取方法。

肌动蛋白是黄瓜细胞骨架的重要组成成分，在维持细胞生长、分化、繁殖等方面都发挥重要作用，肌动蛋白基因Act1作为管家基因常被用作基因组DNA检测中的内参基因[13-14]，Act1基因在黄瓜组织细胞中大量稳定表达，在单倍体基因组上呈单拷贝存在，笔者选择Act1作为标示基因来开展黄瓜基因组DNA的快速提取研究。

1 材料与方法

1.1 材料

供试黄瓜购自菜市场，果实细长，浑身有白刺，属华北型黄瓜。

1.2 方法

1.2.1 样品的制备 将黄瓜分割为表皮、表层果肉与中心果肉，每个部分切割为100 mg的小块，分装于1.5 mL离心管中，-20 ℃保存备用。取100 mg黄瓜表层果肉，采用全式金生物公司的商品化植物基因组DNA提取试剂盒（货号EE111）提取基因组DNA，-20 ℃保存备用，提取产物作为试验中阳性对照樣品。用打孔器将纤维素膜制成3 mm直径圆形膜片备用。

1.2.2 PCR反应液配制与扩增产物分析 参考李楠楠[14]的研究，选取黄瓜Act1基因作为目标基因，参照其基因序列（GenBank：DQ115881.1）使用Oligo 7.0软件设计引物，上游引物hg ACT1 F：5'GTGGTGGTGAATGAGTAGCC3'，下游引物hg ACT1 R：5'TTGGATTCTGGTGATGGTGTC3'，预期扩增产物大小为150 bp，Tm值为60 ℃。按照PCR试剂盒（全式金生物公司，货号AS111-02：）说明书配制PCR反应液20 μL，其中2×PCR Mix：10.0 μL，上游引物0.5 μL（10 μmol·L-1），下游引物0.5 μL（10 μmol·L-1），水：9.0 μL。在阳性对照管中加入0.5 μL 商品化试剂盒提取的黄瓜基因组DNA，阴性对照管中加入0.5 μL清洗缓冲液。PCR反应条件为95 ℃ 1 min;95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，40个循环。反应完成后PCR产物在2%琼脂糖凝胶上进行电泳，用凝胶成像仪观察结果。

1.2.3 黄瓜基因组DNA提取与PCR反应 将黄瓜样品置于1.5 mL离心管中，用玻璃棒研磨至无大块组织，加入100 μL裂解液，充分混匀，室温放置1 min，用镊子加入膜片，确保膜片完全浸入液体中，室温放置1 min，用镊子将膜片取出转移到含有500 μL清洗缓冲液中（10 mmol·L-1 Tris[pH8.0]，0.1% Tween-20）的小管中，室温放置1 min，再将膜片转移到含有Act1基因上下游引物的PCR反应液中，室温孵育1 min，用镊子去除膜片，进行PCR反应。操作流程见图1。

1.2.4 黄瓜裂解液的筛选 以盐酸胍、PVP、CTAB等植物常用基因组DNA提取试剂为主要成分，参照文献[15-17]配制5种裂解液各1 mL，各种裂解液的试剂组成与浓度如表1所示。

将5份分割好的黄瓜表层果肉分别放置于5个1.5 mL离心管中，用玻璃棒研磨至无大块组织，分别加入100 μL裂解液1～5，按照1.2.3的方法进行基因组DNA提取和PCR扩增，扩增产物电泳分析。

1.2.5 黄瓜基因组DNA提取条件的优化 在黄瓜裂解时间的优化中，取黄瓜表层果肉4份，每份100 mg，按照1.2.3方法进行基因组DNA提取和PCR扩增，裂解时间分别设置为1、2、4、8 min。在膜片吸附时间的优化中，取黄瓜表层果肉4份，每份100 mg，按照1.2.3方法进行基因组DNA提取和PCR扩增，膜片吸附时间分别设置为1、2、4、8 min。在洗脱时间的优化中，取黄瓜表层果肉3份，每份100 mg，按照1.2.3方法进行基因组DNA提取和PCR扩增，洗脱时间分别设置为1、2、4 min。扩增产物电泳后进行比较分析。

1.2.6 黄瓜不同部位基因组DNA提取检测灵敏度测定 分别取50、25、13、6 mg黄瓜表皮、表层果肉与中心果肉放入小管中，用玻璃棒研磨至无大块组织，在各管中分别加入100 μL裂解液1，按照1.2.3方法进行基因组DNA提取和Act1基因片断扩增，对扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。

2 结果与分析

2.1 不同裂解液对黄瓜基因组DNA提取的影响

在配制的5种裂解液中，只有裂解液1实现了有效扩增，扩增片断大小约为150 bp，符合产物预期大小，无非特异性条带出现（图2）。

2.2 不同提取时间对黄瓜基因组DNA扩增的影响

在设置的1、2 、4 、8 min的黄瓜裂解时间中，扩增产物量没有明显差异，都可以实现有效扩增（图3），所以在后续试验中将黄瓜裂解时间确定为1 min。

滤膜片吸附时间从1 min到8 min，扩增产物量没有明显差异，都可以实现有效扩增（图4）。滤膜片洗脱时间从1 min到4 min扩增产物量没有明显差异，都可以实现有效扩增（图5）。滤膜片吸附1 min和洗脱1 min都可以实现有效扩增。

2.3 不同黄瓜果实部位对膜吸附提取黄瓜基因DNA灵敏度的影响

在黄瓜表皮的基因组DNA提取灵敏度试验中，50 mg表皮、25 mg表皮和13 mg表皮都实现了有效扩增，可见特异性扩增片段，而且呈渐弱趋势，6 mg表皮未实现有效扩增，黄瓜表皮最少在13 mg可以实现有效提取与扩增（图6）。在黄瓜表层果肉的基因组DNA提取灵敏度试验中，50 mg表层果肉、25 mg表层果肉和13 mg表层果肉都实现了有效扩增，而且呈渐弱趋势，6 mg表层果肉未实现有效扩增，黄瓜表层果肉最少在13 mg可以实现有效提取与扩增（图7）。在黄瓜中心果肉的基因组DNA提取灵敏度试验中，50 mg中心果肉、25 mg中心果肉实现了有效扩增，13 mg和6 mg中心果肉未实现有效扩增，黄瓜中心果肉最少在25 mg可以实现有效提取与扩增（图8）。

3 討论与结论

在简单快速的基因组DNA提取方法中，常用的有高温裂解法[18]、溶液直接裂解法[19]和纤维素膜片法[9]等。高温裂解法通过加热来破坏生物体组织结构，使核酸释放。高温裂解法需要加热设备，而且高温容易使蛋白质变性，变性后的蛋白质将核酸包裹使其不易释放[20]，而且高温也会加速核酸降解。溶液直接裂解法使用强变性溶液直接破坏生物体组织结构，使核酸释放。溶液在裂解组织释放核酸的同时，溶液成分也会滞留在含有核酸的混合液中，从而影响核酸的后续试验操作，这样的组织裂解混合液常常含有抑制DNA扩增的成分[21]。本研究的目的就是在简单的基因组DNA提取方法和能够实现PCR有效扩增之间寻找一个平衡点。直接将黄瓜果实研磨裂解无法扩增获得Act1基因片断（试验结果未展示），这可能是溶液里含有PCR反应抑制成分，或者内源性核酸酶降解了核酸。用简单提取方法获得的基因组DNA一般得率低、纯度低、杂质多，而且往往含有较多的PCR扩增抑制成分。就像黄瓜裂解后的状态，裂解液中有游离的DNA，但也有大量的内源性核酸酶等杂质，无法直接作为模板来进行PCR扩增。笔者利用纤维素膜片对基因组DNA进行吸附，再经过清洗和洗脱获得DNA，虽然这种DNA纯度低、含量少，也会含有杂质，但去除了PCR抑制物，可以作为模板进行PCR反应，实现了简单快捷的目的。特异性核酸片断得到扩增放大后就可以实现多种下游试验操作。

在本研究选用的多种裂解液中，只有含有盐酸胍的裂解液实现了黄瓜基因组DNA的提取和有效扩增。盐酸胍可以溶解蛋白质，导致细胞结构与核蛋白二级结构破坏，基因组得以释放，同时，盐酸胍也是内源性核酸酶的强抑制剂，可以保护核酸免受降解[22]。裂解液裂解了黄瓜组织细胞，释放了基因组DNA，被膜片吸附，DNA在洗脱液中得到洗脱。

在试验操作过程中，黄瓜的裂解、DNA的吸附和洗脱都在很短的时间内就可以完成，充分满足了快速提取基因组DNA的需求。黄瓜果实较大，容易获取，本方法最少可以检测到13 mg黄瓜果实，检测灵敏度可以满足绝大部分的应用需求。黄瓜基因组DNA的提取仅需简单的步骤和少量的试剂，不需要其他仪器或复杂设备，可以在田间地头、市场菜站等场所直接提取基因组DNA，将吸附有基因组DNA的膜片带回实验室再进行扩增检测。这一研究为黄瓜基因组DNA的快速采集与鉴定提供了一种简便方法。

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