四爪陆龟非结核分枝杆菌感染报告

陈谭子芃 植广林 单 芬 黄润基

(广州动物园，广州市野生动物研究中心，广州，510070)

1 材料与方法

1.1 动物

受影响的四爪陆龟属于华南某动物救护站，该站共有22只成年四爪陆龟。它们的饮食包括饲养区域内自然植被与日常加入的水果和蔬菜，以保证85%的草本植物和蔬菜、10%的水果和5%的蛋白质饮食结构[6]。冬眠后(3—4月)，体重在1 150—1 630 g的4只成年个体(3♀，1♂)表现出厌食、虚弱和嗜睡的迹象。另外，在其后肢的远端关节和尾巴中观察到炎症和水肿。

1.2 样品

通过用23G针头和2 mL注射器穿刺后尾静脉获得4个患病个体的血液样本，将每个样本0.6 mL放入2个装有肝素锂作为抗凝剂的试管中(一次性使用真空肝素锂采血管，江苏康捷医疗器械有限公司)。一支试管用于确定血液学参数，另一支用于血液生化参数测定。后者在室温下放置30—40 min，然后3 000 r/min离心10 min，分离血浆，以避免溶血。将获得的血浆保存在-20℃直至分析。

1.3 血液学和血液生化检测

血液学参数包括红细胞计数(RBC)、红细胞体积(PCV)、血红蛋白质量浓度、白细胞计数(WBC)和白细胞差异计数。用微量血细胞比容离心机以3 000 r/min测定PCV；通过自动血液分析仪测定血红蛋白质量浓度。使用血细胞计数器和白细胞稀释液测定RBC和WBC[7]。在具有Diff-Quick样染色的血液涂片上对100个白细胞进行差异计数。对血浆样品进行生化分析，这些样品在宏观上没有显示溶血或血脂。分析指标包括总蛋白、尿素、尿酸、葡萄糖质量浓度和氯化物、钾、钠、钙、磷的离子浓度，以及血浆谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、肌酸激酶(CK)、碱性磷酸酶(ALP)和乳酸脱氢酶(LDH)活性。通过自动分析仪(Catalyst One®，IDEXX，美国)的干式试剂片测定。

1.4 细胞学测定

用聚维酮-碘消毒，通过细针穿刺患病个体的股骨关节，抽取滑液样本。根据标准程序进行涂片并用Diff-Quick染色剂和抗酸染色剂染色。

1.5 尸检

收集4只四爪陆龟(ID标注为C-50、C-51、C-54、C-103)的尸检数据和组织样品用于组织病理学检查和培养。

1.6 组织培养与病理学

将尸检中收集的样品切成3 mL厚的块，并在体积分数10%的福尔马林中静置6 h。常规处理，包埋在石蜡中，切成4 μm厚的组织切片，用苏木精和伊红染色。另外，对观察到肉芽肿的组织，制作相同厚度的新组织切片，并用抗酸技术染色以检测分枝杆菌。考虑到肉芽肿性病变的细胞学特征，将其分为3种类型：嗜异性、组织细胞性和混合性[8]。

1.7 细菌培养和分子生物学鉴定

在室温下，将用于微生物分析的每个样品(1—3 g)在10 mL质量浓度1.5%的十六烷基吡啶基氯中去污染1 h。对于每个样品，将1 mL匀浆后的悬浮液转移至固体培养基中，将其在培养管中37℃倾斜温育，瓶盖半封闭，经过4—5 d，液相蒸发干燥后，拧紧瓶盖，在37℃下孵育2个月。在第1周每天观察1次培养物，然后每周观察1次。使用抗酸染色在显微镜下检查所有生长的菌落。将抗酸菌落在新的培养管中继代培养，并保存在收集器中直到分型。通过酸化方法提取分枝杆菌酸，并用4-溴苯甲酰基溴衍生化，以反相高效液相色谱法(HPLC)分析分枝杆菌衍生物，并以其峰形的分布及峰的相对保留时间、相对峰高为指标对分枝杆菌进行分型鉴定[9]。

从每个石蜡块上切下组织切片(30 μm)，并置于无菌微量离心管中。用1.2 mL的二甲苯萃取除去石蜡，13 000 r/min离心5 min，用1.2 mL无水乙醇萃取2次，从组织沉淀中除去残留的二甲苯。将样品离心(13 000 r/min，5 min)，并小心除去乙醇。使用商用DNA提取试剂盒从组织沉淀中提取用于PCR分析的DNA，并使用专为检测小分子细菌而开发的宽范围PCR分析法筛选分枝杆菌DNA。采用引物M65-Myco F(5′-GG(G/C/T)CT(G/C)AA(A/G)GG(C/T)GGCATCG-3′)和M65-Myco R(5′-AGGCT(A/G)CCAT(G/C)G(A/T)CTGGTC-3′)[10]扩增相对分子质量为65 000的热休克蛋白(hsp65)基因的137 bp片段。该基因是所有分枝杆菌共有的，比其他靶基因具有更大的可变性，因此足以鉴定遗传相关物种。

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2 结果与分析

2.1 血液学与血液生化

由血液学结果(表1)可见，C-51、C-54、C-103单核细胞增多，但只有C-103的白细胞升高，这与鸟类(Aves)中炎症性疾病血液学单核细胞和白细胞同时增多[11]不一致。尽管在解剖中观察到动物肾脏损害，但其血尿素和尿酸仍在正常范围内，提示肾脏疾病可能很难通过血液生化检测确诊。ALT在血液生化数据中数值偏高，虽然肾脏病变也是ALT升高的主要原因，但是当发生肾脏疾病时，这些酶会在尿液而非血液中释放，ALT活性升高提示可能肝脏损伤[11]。本次报告中动物表现出AST活性增加，因4只四爪陆龟肝脏、四肢都有坏死病变，可能由败血症和内毒素血症引起与组织坏死相关的AST升高[11]。同时也观察到高蛋白血症，可能与慢性炎症疾病中的脱水和球蛋白质量浓度增加有关[11]。

表1 四爪陆龟的血液学和生化指标Tab.1 Hematologic and biochemical values of Testudo horsfieldii with mycobacterial infection

2.2 细胞学

关节抽吸物的显微镜分析显示，存在大量单核细胞，形态上与泡沫反应性巨噬细胞一致，抗酸染色阳性。

2.3 尸检

尸检时，观察到4只乌龟后肢的远端关节都有肿胀和浮肿。在肝、肺、脾、心脏、肌肉、肾脏和卵巢中观察到肉芽肿性病变，其中，肝脏均增大，边缘呈钝圆，颜色为黄色至棕色。在尸检的四爪陆龟中观察到与内脏痛风一致的病变。在C-51和C-103中，在肾脏表面和横截面均可见肾尿酸盐晶体沉积，与内脏痛风一致。在被检龟中，脾脏主观上增大。在C-50的肌肉筋膜之间的皮下组织和C-50、C-54的心包膜表面的组织中也发现了尿酸盐沉淀。在存在数个不规则坏死灶的情况下，C-51和C-103的心房壁厚度在主观上都增加了。C-51和C-54的肺部大量充血，大量的白色小结节随机分布在薄壁组织中。在胃肠道中未观察到明显损伤。胃中残留有部分未被消化的草。

2.4 组织病理学

在4个尸检龟中，均观察到肉芽肿性病变(表2)。在C-51中，受影响最大的器官是脾脏，脾实质被多灶性至合并的组织细胞性肉芽肿完全取代。在肉芽肿的周围和囊下空间中有散在的剩余淋巴样组织受压(图1A)。但是心脏、肝脏和肾脏也受到了严重影响，如肝存在典型的组织细胞肉芽肿，其中央有坏死碎片的核心，核心边缘是上皮样巨噬细胞，再外围是厚边缘的多核巨细胞，更外围是纤维结缔组织囊(图1B)。器官中的肉芽肿性病变大多与组织细胞性或混合性一致。在肺和皮肤中，发现了多处病灶内菌丝丰富的真菌性肉芽肿。

在C-50中，受影响较大的器官是肌肉、皮肤和肝脏。在肌肉和肝脏中，主要是组织细胞性肉芽肿，而在皮肤中，组织细胞性肉芽肿和混合性肉芽肿以及异嗜性肉芽肿都被检测到。

在C-54中，卵巢、肝和肺显示出散在的异嗜性和混合性肉芽肿。

在C-103中，脾脏的结构完全消失，并被组织细胞性肉芽肿和混合性肉芽肿所取代。肾脏、肝脏和心脏也有多发性肉芽肿，既有组织细胞性的又有混合性的。

在所有样本中，抗酸染色均显示肉芽肿性病变中存在可变数量的耐酸生物，抗酸结果阳性，分枝杆菌同时存在于巨噬细胞的细胞质中，并分散在肉芽肿的坏死中心。

2.5 细菌培养和PCR

延长培养时间(10周)，随后进行HPLC分析，得出1种霉菌酸模式，类似于非结核分支杆菌。所有抗酸阳性标本均产生了预期大小的DNA片段。为了进一步鉴定感染的分枝杆菌菌株，直接对hsp65的PCR产物进行测序。4只四爪陆龟标本在氨基酸水平(44个氨基酸残基)上与结核分枝杆菌的hsp65序列显示出最高的相似性。在所有4种样本下均确定了物种级别的明确分类；序列分析显示与非结核分支杆菌的相应序列具有100%的相似性。

3 讨论

传染病可导致圈养爬行动物的大量死亡，如果在早期诊断，可以适当治疗。革兰氏阴性细菌是最常与传染病有关的病原体，而革兰氏阳性菌(如分枝杆菌)很少与爬行动物的疾病相关[14]。分枝杆菌在水中无处不在，爬行动物感染通常是不适当的处理(应力，温度、湿度和营养不足)所致[15]。尽管这是一种罕见的疾病，但据Mitchell[15]报道相比于其他爬行动物该病更常见于龟类。

分枝杆菌感染可能会出现各种临床体征和病变，具体取决于物种以及受影响的器官和系统。本研究中的四爪陆龟受到肉芽肿性病变的影响，肉芽肿性病变位于后肢、尾巴、肝脏、肺、心脏、肾脏、脾脏和卵巢的远端。

由于缺乏特定的临床体征，爬行动物中的分枝杆菌病的临床诊断可能很困难。所有肉芽肿性病变伴有体重减轻的情况下，都应考虑感染分枝杆菌[15]。

许多细菌、真菌和寄生虫感染爬行动物倾向于发展为肉芽肿性炎症，根据病因，宿主的细胞反应、外在因素(例如温度和病程的慢性)可将其分为嗜异性、组织细胞性或混合性感染[8]。在急性分枝杆菌病中，干酪样病变主要与嗜异性粒细胞和巨噬细胞浸润有关。在慢性分枝杆菌病中，典型的肉芽肿性炎症伴随结节的发展。随着时间的流逝，肉芽肿的发展范围从致密的嗜异性粒细胞聚集和中央坏死，到更复杂的肉芽肿，其中包含被大量巨噬细胞包围的干酪样中心，上皮样细胞和多核巨细胞，以及淋巴细胞和浆细胞。这些通常由致密的纤维囊在周围界定。在四爪陆龟中观察到的肉芽肿大多是组织细胞性的，但也有混合性的。这些动物可能在冬眠时已被感染，因此分枝杆菌感染变得相当慢性[15]。

四爪陆龟C-51还表现出多发性真菌性嗜异性肉芽肿和混合性肉芽肿，并伴有病灶内菌丝。陆龟的真菌病患病率似乎较低，但环境温度低和免疫力低下的动物通常被认为具有潜在感染可能[16]。在本研究中，因为动物脾、肝和肾被大量分枝杆菌肉芽肿严重破坏，应该会影响免疫力，所以这可能是机会性真菌感染。

分枝杆菌在爬行动物中的传播方式尚不清楚。患有肌肉骨骼和免疫系统疾病的动物更容易感染，其他风险因素包括应力、营养失调和慢性疾病，以及皮肤损害(包括微芯片应用)也被认为是分枝杆菌感染的重要因素[15]。在报告中的四爪陆龟在冬眠期，白细胞值处于最低水平，使它们更容易受到感染。啮齿动物(如鼠)咬伤龟，会引起皮肤的病变，增加分枝杆菌感染的概率，特别是在休眠期间动物更容易感染，咬伤通常使龟外壳、四肢和尾巴等较远端部位出现病变，但本报告中四爪陆龟未观察到此类迹象。口腔和口腔的病变已被认为可增加爬行动物的感染[16]，但是，这不太可能在本报告的四爪陆龟中起作用，因为在其舌头和胃肠道中均未观察到病变。

爬行动物通常被当作宠物饲养。当被感染的动物没有临床症状时，一般不予治疗，则可能会将疾病传播给人类，且传播的风险更高[5]。对爬行动物分支杆菌感染的治疗局限于使用异烟肼、乙胺丁醇、利福平或阿米卡星等，由于人畜共患病的可能性和治疗的困难性，在全身性分枝杆菌感染的病例中应考虑安乐死。

综上，尽管非结核分枝杆菌感染在爬行动物中很少见，但有必要采取严格的卫生和预防措施，尤其是对于具有较高生态价值的受严格保护的物种。如果将圈养的动物用于再引进项目，则控制措施应更加严格，以防止病原体在野生种群中引入和传播。