多金属氧酸盐抑制酪氨酸酶活性研究进展

王安杏 方向红 张 庆

（安徽职业技术学院 环境与化工学院，安徽 合肥 230011）

我国果蔬产量位居世界第一，但因保鲜不当导致的果蔬损耗率为20%～30%，每年因此造成的损耗超过4 000亿元[1]。酶促褐变是果蔬损耗的主要原因。酶促褐变不仅会影响果蔬外观和风味，还会降低果蔬营养及经济价值。酶促褐变指果蔬中酚类化合物在酚酶催化下氧化成邻醌类化合物，醌类物质经过一系列氧化缩合聚合形成褐色产物，从而导致褐变发生[2]。因此，控制果蔬相关酶活性是防止和延缓果蔬褐变的重要手段，也是延长果蔬货架期、保持果蔬品质的重要手段。

酪氨酸酶，又称多酚氧化酶（PPO），是一种含铜多功能氧化酶，主要存在于动植物和微生物中，是生物体合成黑色素的关键酶。在疾病方面，酪氨酸酶活性的异常表达会引起色素沉着性疾病[3]。在食品领域，酪氨酸酶是引起果蔬发生酶促褐变的主要酶[4]。酪氨酸酶具有单酚酶活性和双酚酶活性，可先将L-酪氨酸羟基化为L-3，4-二羟基苯丙氨酸（L-DOPA），再氧化L-DOPA为多巴醌，醌是高活性物质，能自发聚合形成黑色素[5]。酪氨酸酶抑制剂是通过降低酪氨酸酶活性而抑制黑色素合成，目前主要有天然提取物[6-7]、有机合成物[8]和无机化合物[9]。目前商业化的酪氨酸酶抑制剂是曲酸[10]和熊果苷[11]，但熊果苷对细胞有潜在毒性，而曲酸在治疗浓度下会引起皮肤过敏[12]。因而开发新型、安全、高效的酪氨酸酶抑制剂已成为食品保鲜领域的研究热点。

多金属氧酸盐（POM）是一类无机金属氧簇化合物，由于其独特的结构和优异的性能，不仅广泛用于工业催化[13]，而且用于生物医学[14-15]，具有抑菌[16-17]、抗病毒[18]、抗癌[19]、抗糖尿病[20]等特性。此外POM还具有很好的抑酶作用[3]，尤其是对酪氨酸酶的抑制[21]，有望使POM在果蔬保鲜方面应用广泛。

1 多金属氧酸盐（POM）对酪氨酸酶的抑制作用

从抑制效果、抑制机理、抑制类型三方面来探讨POM对酪氨酸酶的抑制作用。

1.1 抑制效果

POM对酪氨酸酶的抑制效果主要通过酶动力学法[22-23]研究。酶动力学法是基于酪氨酸酶催化底物单酚（L-酪氨酸）或双酚物质（L-DOPA）生成的产物在475 nm波长处有最大吸收峰，通过紫外-可见分光光度法测量吸光度，从而测定酪氨酸酶活力。酶动力学方法主要是通过IC50和抑制常数等参数综合比较不同POM对酪氨酸酶抑制能力大小。

抑制效果实验主要是通过固定酶量和底物浓度，测定不同浓度抑制剂体系吸光度值随时间变化的曲线，根据直线的斜率计算酶活力。以相对剩余酶活力对抑制剂浓度作图，由图可知酶活力下降50%对应的抑制剂浓度即为半抑制浓度（IC50），一般IC50越小说明抑制剂的抑酶效果好。POM对酪氨酸酶单酚酶活力的影响主要表现为对酶稳态活力的抑制作用，并有迟滞时间，抑制剂对酪氨酸酶二酚酶活力的抑制没有迟滞过程[24]。

表1 酶动力学参数

1.2 抑制类型

抑制类型实验主要是通过固定酶量，改变底物浓度，测定不同浓度抑制剂体系酪氨酸酶酶活力。可通过双倒数作图法，即以反应速率倒数对底物浓度倒数作图，测定抑制剂如何与酶结合，确定抑制类型。以双倒数图中直线斜率和纵轴截距分别对抑制剂浓度进行二次作图，可分别求得KI和KIS，从而判断抑制剂对酪氨酸酶的抑制类型[25]。一般抑制剂对酪氨酸酶的抑制类型有竞争性抑制、非竞争性抑制、反竞争性抑制和混合型抑制[26]。

1.3 抑制机理

抑制机理实验主要是通过固定底物浓度，改变酶量，测定不同浓度抑制剂体系酪氨酸酶酶活力，以酶活力对酪氨酸酶浓度作图判断抑制机理是可逆抑制还是不可逆抑制。可逆抑制中，抑制剂与酶以非共价键结合，通过抑制酶活力而导致催化效率降低，而不是通过减少有效酶量导致酶活力下降[27]。可逆抑制的特点是以酶剩余活力对酶浓度作图，得到一组通过原点的直线，并且直线的斜率随抑制剂浓度增大而降低。不可逆抑制中，抑制剂与酶以共价键结合使有效酶量减少而抑制酶活性[28]。不可逆抑制的特点是以酶剩余活力对酶浓度作图，得到的一组在X轴上截距不同的平行直线，直线在横坐标上的截距随抑制剂浓度增大而逐渐增大。

2 不同结构的多金属氧酸盐（POM）抑制酪氨酸酶活性

POM主要有六种典型结构[14]，其中在抑制酪氨酸酶活性方面研究较多的是Keggin型[29]和Dawson型[30-31]。

2.1 Keggin型POM抑制酪氨酸酶活性

2.1.1 不同类型Keggin型POM抑酶活性

目前研究较多的抑制酪氨酸酶活性的Keggin型POM主要是磷钨酸、磷钼酸和硅钨酸及其对应过渡金属取代物。其中纯POM对酪氨酸酶二酚酶的抑制效果为H3PMo12O40>H3PW12O40>H4SiW12O40，这可能是由于中心原子和配位原子不同使POM具有不同的氧化性和酸性。不同过渡金属取代POM的抑酶活性具有差异，这可能与过渡金属的离子半径有关。

邢蕊[32]研究发现甘氨酸基的过渡金属取代的磷钼酸盐对酪氨酸酶二酚酶的抑制效果均优于对应的过渡金属取代的磷钼酸盐，可能是由于甘氨酸基与杂多阴离子形成无机-有机大分子复合物，其与酶相互作用产生较大的空间位阻而有效地抑制了酶活性，同时还发现（HGly）4SiW12O40的抑酶作用强于（HGly）3PW12O40，分析可能是因为反荷离子质子化甘氨酸、杂多阴离子电荷数以及POM还原性差异引起的。

表3 Keggin型POM对酪氨酸酶的抑制作用

2.1.2 影响Keggin型POM抑酶活性的因素

Joscha Breibeck等[33]研究发现结构完整的α-Keggin结构的POM对蘑菇酪氨酸酶二酚酶的抑制行为具有电荷依赖性，POM的抑酶能力与其杂多阴离子的净电荷成反比，对净电荷较低的K4SiW12O40和Na3PW12O40，POM的抑酶作用被它们显著的水解作用部分抵消，而对于杂多阴离子电荷数为5和6的POM对酪氨酸酶二酚酶无抑制作用，甚至具有激活作用。在研究体系（pH=6.8）中，K4SiW12O40部分水解，但仍显示出最强的抑制作用，而Na3PW12O40由于完全水解为中等活性的物质，所以抑酶作用弱于K4SiW12O40。

影响POM抑酶活性的因素主要有中心原子、配原子、反荷离子、杂多阴离子电荷数、POM酸性、POM氧化还原性质等。POM的结构和组成对抑酶活性具有非常重要的影响。然而目前只针对Keggin型杂多阴离子电荷数这一种因素系统研究了其对POM抑酶活性的影响，未来还需要详细研究其他因素的影响，便于总结规律，为设计酪氨酸酶抑制剂提供理论依据。

2.1.3 Keggin型POM抑酶机制

Chi等[34]合成了H3PMo12O40、Na7PMo11CoO40、Na7PMo11ZnO40，通过分子模拟研究了 POM对酪氨酸酶的作用机制，分子模拟研究与三种化合物的体外生物活性有很好的相关性。分子对接结果表明三种POM对酪氨酸酶具有很强的结合能力，POM主要通过与酪氨酸酶中的Cu2+离子及能够形成阳离子-π和氢键的氨基酸残基的更多相互作用而竞争性结合酪氨酸酶，从而形成可逆的非共价复合物。三种POM中H3PMo12O40的抑酶活性最高，可能是因为H3PMo12O40能与酪氨酸酶中的His61 and His85两种氨基酸残基形成阳离子-π相互作用，而另外两种POM仅能与一种氨基酸残基产生阳离子-π相互作用，所以POM对酪氨酸酶的结合亲和力和抑制能力会降低。

2.2 Dawson型POM抑制酪氨酸酶活性

由表4可知，目前研究较多的抑制酪氨酸酶活性的Dawson型POM主要是磷钼酸及其过渡金属取代物，并且对酪氨酸酶二酚酶的抑制均为可逆竞争性抑制。李莉莉等[35]研究了不同数目钒取代的Dawson型磷钼酸对酪氨酸酶二酚酶活性的抑制，发现随着取代钒原子数的变化，POM的抑酶活性不同，推测可能是由于不同个数的钒原子取代影响了POM与酶的结合方式，从而造成抑酶活性的差异。由表4，根据IC50值可知取代型Dawson型磷钼酸的抑酶活性为H8[P2Mo17Zn（OH2）O61]>H8[P2Mo17Cu（OH2）O61]>H7[P2Mo17Fe（OH2）O61]>H8[P2Mo17Mn（OH2）O61]>H8[P2Mo17Co（OH2）O61]>H8[P2Mo17Ni（OH2）O61]>H6[P2Mo18O62]>H8[P2Mo17Cr（OH2）O61]，这可能与过渡金属元素的离子半径有关，也可能与元素的氧化还原电位有关。Hu等[36]合成了α/β-K6P2W18O62.10H2O，并研究了其对酪氨酸酶单酚酶和二酚酶活性的抑制作用，结果发现α/βK6P2W18O62.10H2O对单酚酶的抑制作用强于二酚酶，对酪氨酸酶二酚酶的抑制为不可逆非竞争性抑制。

表4 Dawson型POM对酪氨酸酶的抑制作用

3 多金属氧酸盐在果蔬保鲜中的应用实例

目前POM用于果蔬保鲜的实例并不是很多，主要是用于鲜切苹果片、藕片、红毛丹果实的保鲜，并且都是通过浸泡的方式达到保鲜的效果。

Chen等[28]合成了α-Na8SiW11CoO40（SiW11Co），研究了其对蘑菇酪氨酸酶活性的抑制作用及对鲜切苹果片的保鲜效果，结果发现SiW11Co能够有效抑制酪氨酸酶的活性，且存在剂量效应，经过SiW11Co处理的苹果片保持了苹果的营养成分，显著降低了苹果的褐变程度，抑制多酚氧化酶的活性，提高过氧化物酶活性，促进酚类化合物和抗坏血酸含量的增加。李莉莉、迟国祥等[37-38]通过测定多项指标评价H8[P2Mo17Mn（OH2）O61]（P2Mo17Mn）对鲜切苹果的保鲜效果，结果表明P2Mo17Mn能够有效减少鲜切苹果水分的散失，显著延缓苹果质量的损失和褐变进程，减缓丙二醛含量的增加以及多酚氧化酶活性的增加，促进过氧化物酶活性的增加，保持较好的色泽、香味、硬度和质地，延长了苹果的货架期。

Xing等[39]研究了Na6PMo11FeO40（PMo11Fe）对蘑菇酪氨酸酶的抑制作用及对藕片保鲜的影响，发现PMo11Fe对酪氨酸酶活性有显著的抑制作用，且存在剂量效应。通过测量相关生理生化指标说明PMo11Fe能够显著减缓藕片褐变速度，抑制多酚氧化酶活性，增强过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性，维持较高水平的谷胱甘肽、抗坏血酸和蔗糖。郑阿萍[40]研究了POM对红毛丹果实保鲜的简单应用实验，使用POM浸泡新鲜红毛丹，取出风干、贮藏，观察果实褐变程度，发现PW12的保鲜效果优于其他三种POM。

4 总结与展望

POM在果蔬保鲜领域的应用范围应进一步扩展，而不仅仅局限于苹果、藕片等。此外应该详细研究不同因素对POM抑制酪氨酸酶活性的影响，确立POM对酪氨酸酶的结构-抑制关系。POM和酪氨酸酶在分子水平上的反应机制基本未知，需从分子水平上开展POM对酪氨酸酶的作用机制研究，为设计新型、安全、高效的酪氨酸酶抑制剂提供理论依据。

目前已经用于果蔬保鲜应用的POM都是通过浸泡的方式达到保鲜效果，POM容易渗透到果蔬组织内部，POM在生物体内经过代谢是否会产生对生物体不利的衍生物和有毒物质尚不清楚，应探索新的保鲜方式，如将POM与其他材料复合合成新型食用膜。尽管POM的生物活性已经研究了很多年，但相关毒理学研究报告相对较少，所以应加强POM在生物体内的活性研究，进行毒理学分析，探索POM对生物体健康的影响，以期筛选出安全、高效的果蔬保鲜剂。