高效液相色谱法同时测定化妆品中9 种二苯甲酮类紫外吸收剂

2021-11-13鲁素雅邢海艳吴义春金鹏

化学分析计量 2021年10期

鲁素雅，邢海艳，吴义春，金鹏

（淮安市食品药品检验所，淮安 223005)

防晒类化妆品因具有保护人体皮肤免受紫外线辐射损伤的功效而受到广大消费者的青睐，其主要活性成分为防晒剂。防晒剂是指利用光的吸收、反射或散射作用，以保护皮肤免受特定紫外线所带来的伤害或为保护产品本身而在化妆品中加入的物质。按防晒机制不同，防晒剂可分为物理防晒剂和化学防晒剂两类。防晒剂对皮肤有保护作用，但是使用过量也会影响皮肤健康，如过敏、泛红、光敏、发炎等［1-4］。《化妆品安全技术规范》 2015 年版（简称《技术规范》）中规定了27 种准用防晒剂，其中包括2 种物理防晒剂和25 种化学防晒剂［5-6］。二苯甲酮类化合物是一类具有紫外吸收功能的高分子材料，其吸收波长范围广，同时具有防长波紫外线（UVA）和中波紫外线（UVB）的功能，是目前国内外常用的防晒剂。但二苯甲酮类也是环境激素，会干扰生物体和人体内分泌，造成精子数量减少，并导致不孕症等不良反应［7-10］，因此《技术规范》中明确规定了可作为防晒剂使用的品种和最大使用浓度，其中二苯酮-3、二苯酮-4／5 是准用防晒剂，最大使用浓度分别为10%和5%，二苯酮-5 是二苯酮-4 的钠盐形式，实际使用以二苯酮-4 计算，并且仅规定了二苯酮-2的检测方法并用于此类化合物的检测与监管，而对化妆品中其它二苯甲酮类化合物含量的测定则未作规定，因此不利于对此类化合物的监管和产品质量控制［11］。

高效液相色谱（HPLC）法是化妆品检验中较常使用的方法，其检测范围广，对样品要求较低，对极性和非极性化合物均能达到有效的分离。唐娜等［12］采用高效液相色谱法测定了化妆品中山梨酸和脱氢乙酸；肖庚鹏等［13］采用柱前衍生-高效液相色谱法测定了化妆品中牛磺酸；陈静等［14］采用高效液相色谱法同时测定了化妆品中8 种防腐剂；杨淡梅等［15］采用高效液相色谱法同时了检测染发类化妆品中16 种禁用着色剂。笔者通过对样品处理及HPLC条件进行了优化，建立了同时测定化妆品中9 种二苯甲酮类紫外吸收剂的高效液相色谱法，为市场监管与检测提供数据与方法支撑。

1 实验部分

1.1 主要仪器与试剂

高效液相色谱仪：Waters 2695／2998 型，美国沃特世公司。

超声清洗仪：KQ-250DV 型，昆山市超声仪器有限公司。

超纯水机：美国密理博公司。

有机系针筒式微孔滤膜：0.45 μm，上海安谱公司。

电子天平：XS205D 型，感量为0.01 mg，美国梅特勒公司。

甲醇、乙腈、四氢呋喃：均为色谱纯，德国默克公司。

高氯酸：分析纯，南京化学试剂股份有限公司。化妆品样品：共15 批，市购。

二苯甲酮类标准物质：基本信息见表1。

表1 二苯甲酮类标准物质基本信息

1.2 仪器工作条件

色谱柱：Waters Symmetry C18柱（250 mm×2.1mm，5 μm，美国沃特世公司）；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液；洗脱方式：梯度洗脱，洗脱程序见表2；流量：1.0 mL／min，进样体积：10 μL；柱温：30 ℃；检测器：二极管阵列检测器；检测波长：322 nm。

表2 流动相梯度洗脱程序

1.3 溶液配制

9 种二苯甲酮标准溶液：1.0 mg／mL，分别称取9 种二苯甲酮类标准物质（BP-1、BP-2、BP-3、BP-4、BP-6、BP-7、BP-8、BP-10、BP-12）各10 mg（精确至0.01 mg），分别置于9 只10 mL 容量瓶中，分别加入乙腈溶解并稀释至标线，混匀。

9 种二苯甲酮混合标准溶液：分别移取BP-1、BP-2、BP-3、BP-6、BP-10、BP-12 标准溶液各2.5 mL，BP-4、BP-7、BP-8 标准溶液各5.0 mL，置于同一只100 mL 容量瓶中，用乙腈稀释并定容至标线，混匀，配制成BP-1、BP-2、BP-3、BP-6、BP-10、BP-12 的质量浓度均为25 μg／mL，BP-4、BP-7、BP-8 的质量浓度均为50 μg／mL 的混合标准溶液。

9 种二苯甲酮系列混合标准溶液：依次移取9种二苯甲酮混合标准溶液0.1、0.2、0.5、1、2、5 mL，分别置于6 只10 mL 容量瓶中，用乙腈稀释至标线，混匀，配制成BP-1、BP-2、BP-3、BP-6、BP-10、BP-12 的质量浓度均分别为0.25、0.5、1.25、2.5、5、12.5 μg／mL，BP-4、BP-7、BP-8 的质量浓度均分别为0.5、1.0、2.5、5、10、25 μg／mL 的系列混合标准溶液。

1.4 样品处理

称取样品约1.0 g，置于50 mL 具塞试管中，加入30 mL 乙腈，超声提取30 min，冷却，用乙腈稀释至50 mL，混匀，静置，过滤，取续滤液作为样品溶液，待测。

2 结果与讨论

2.1 溶剂选择

称取3 份阴性样品，各1.0 g，分别加入1.3 中的9 种二苯甲酮混合标准溶液5 mL，分别选取乙腈、四氢呋喃、甲醇-四氢呋喃-水-高氯酸混合溶剂（体积比为250∶450∶300∶0.2）为提取溶剂，按照1.4方法处理样品，在1.2 仪器工作条件下进样测定，计算不同溶剂提取时9 种二苯甲酮的回收率，结果见表3。由表3 可知，以乙腈为提取溶剂时，样品的回收率较高，重复性好；用四氢呋喃为提取溶剂时，各组分回收率均偏低；采用混合溶剂提取时测定结果重复性较差，故选取乙腈作为提取溶剂。

表3 不同溶剂提取时9 种二苯甲酮的回收率 %

2.2 取样量选择

分别称取阴性样品0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 g，各加入1.3 中的9 种二苯甲酮混合标准溶液5 mL，按照1.4 方法处理样品，在1.2 仪器工作条件下进样测定，比较不同取样量时样品的加标回收率，结果见表4。

表4 不同取样量时9 种二苯甲酮的回收率 %

由表4 可知，不同取样量对分析结果影响不明显。采用IBM SPSS Statistics 22 统计软件对检测结果进行配对样本t检验［16］，t值均大于0.05，故不同取样量对样品提取回收率的影响无统计学差异（t≥0.05）。由于化妆品基质较复杂，为避免由于取样量太少使化合物检测量小于检出限，或取样量过大污染仪器与色谱柱，选择取样量为1.0 g。若样品中化合物检出浓度超出标准曲线线性范围可适当稀释后再检测。

2.3 色谱条件

2.3.1 色谱柱选择

分别比较Phenomenex Luna C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、资生堂Capcell PAK C8柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、资生堂Capcell PAK C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）、资生堂Capcell PAK CR柱（150 mm×2.0 mm，5 μm）、Waters Symmetry C18柱（250 mm×2.1 mm，5 μm）5 种不同型号的色谱柱对9 种二苯酮类紫外吸收剂的分离效果。结果表明，C8色谱柱不能将9 种化合物有效分离；使用CR色谱柱分离时，前8种化合物出峰时间比较密集；采用C18色谱柱时，9 种化合物均能有效分离，其中采用Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×2.1 mm，5 μm）分离时，峰型尖锐，各化合物响应较高，故选取Waters Symmetry C18色谱柱（250 mm×2.1 mm，5 μm）对9 种二苯酮类紫外吸收剂进行分离。

2.3.2 流动相选择

分别选择乙腈-0.1%甲酸溶液、甲醇-0.1%甲酸溶液、乙腈-水作为流动相对9 种二苯甲酮混合标准溶液进行梯度洗脱，在1.2 仪器工作条件下进样测定，结果如图1 所示。由图1 可以看出，由于甲醇洗脱能力小于乙腈，各组分出峰较晚且集中，以乙腈-水和甲醇-0.1%甲酸溶液作为流动相时，二苯酮-4／5 峰型不尖锐，与以乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相时相比保留时间变化较大。结合3组流动相梯度洗脱出峰情况及使用乙腈作提取溶剂，最终选择乙腈-0.1%甲酸溶液作为流动相。

图1 不同流动相时9 种二苯甲酮混合标准溶液色谱图

2.3.3 检测波长选择

分别考察了9 种二苯酮类紫外吸收剂在210～400 nm 的特征吸收峰分布情况。结果显示，9种二苯酮类化合物在210～350 nm 紫外波长范围内均有特征吸收，其中二苯酮-4 和二苯酮-7 的响应较低，故选择二苯酮-4 和二苯酮-7 响应相对较高的322 nm 作为检测波长。

2.4 基质效应

分别称取防晒喷雾、防晒霜、隔离霜、粉底液4种空白基质样品各1.0 g，按照1.4 样品处理方法，分别制备防晒喷雾、防晒霜、隔离霜、粉底液空白基质溶液，分别加入1.3 中的9 种二苯甲酮混合标准溶液0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0 mL 配制成基质标准溶液，在1.2 仪器工作条件下进样测定，以二苯甲酮的质量浓度（x）为横坐标，以对应的色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性方程。以4 种基质标准曲线方程的斜率（k1）与用乙腈配制的标准溶液绘制的标准曲线斜率（k2）进行比较，斜率的比值见表5。

表5 基质标准曲线斜率与乙腈配制标准曲线斜率的比值

由表5 可知，测定的斜率比值为0.985～1.068，说明该提取方法对4 种不同基质提取后，基质效应较小，可直接采用乙腈配制标准溶液进行定量分析。

2.5 线性方程、检出限与定量限

在1.2 仪器工作条件下，对1.3 中的9 种二苯甲酮系列混合标准溶液进样测定，以二苯甲酮的质量浓度（x）为横坐标，以对应的色谱峰面积（y）为纵坐标，绘制标准曲线，计算线性方程和相关系数。

另取阴性样品1.0 g，分别加入不同浓度的9 种二苯甲酮混合标准溶液，按照1.4 方法处理样品，在1.2 仪器工作条件下进行测定，以3 倍信噪比（S／N）对应的二苯甲酮的含量为检出限，以10 倍信噪比对应的二苯甲酮的含量为定量限。9 种二苯甲酮类紫外吸收剂的线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限表6。

表6 线性范围、线性方程、相关系数、检出限及定量限

2.6 加标回收与精密度试验

取阴性样品1.0 g，分别加1.3 中的9 种二苯甲酮混合标准溶液0.5、1.0、5.0 mL，按1.4 方法处理样品，制备成3 个不同浓度水平的加标样品溶液，每个浓度点平行制备6 份，在1.2 仪器工作条件下进行测定，结果见表7。

表7 加标回收与精密度试验结果

续表7

由表7 可知，9 种二苯甲酮类紫外吸收剂的加标回收率为89.84%～112.04%，测定结果的相对标准偏差为0.2%～7.7%，表明该方法具有良好的准确度和精密度。

2.7 实际样品测定

按所建方法，对市售的15 批化妆品样品进行测定，结果见表9。由表9 可知，有2 批样品检出二苯酮-3，含量分别为1.53%和5.95%，未超出10%的使用限度；有1 批样品检出禁用物质二苯酮-10，含量为12.6 μg／g。在15 批样品中均未发现有干扰目标物测定的杂质峰。代表性的防晒霜样品的色谱图如图2 所示，从图中可知，化妆品中基质未干扰目标物的测定。