LncRNA MALAT1靶向miR-34a调控弥漫性大B细胞淋巴瘤细胞的增殖和凋亡

赵 寅，沈 芩，万阳阳

（四川大学华西医院血液科，成都 610041）

弥漫性大B 细胞淋巴瘤（DLBCL）是非霍奇金淋巴瘤（NHL）中经常见到的一种疾病，占所有病例的1/3。这类淋巴瘤占临床上的“侵袭性”或“中高度恶性”淋巴瘤的大多数病例。以前的治疗方式主要是化疗，但是副作用比较大，预后不良[1-2]。已经有许多研究报道，LncRNA参与了DLBCL的生物学功能和作用，调控其发生和发展。LncRNA HULC 在DLBCL 患者中的表达具有重要的临床意义[3]；LncRNA MUC5 B-AS1 在DLBCL 中的表达在临床上具有十分关键的作用[4]；LncRNA RP11-513G11.1 参与了DLBCL的发生和发展[5]。也有很多研究发现，miRNA 在DLBCL 的也有一定程度的表达，影响其发展进程。miR-148b参与调控DLBCL药物敏感性机制[6]；DLBCL 患者中miR-149-5p 表达下调，通过凋亡途径影响肿瘤的发生[7]。本实验旨在研究LncRNA MALAT1 靶向miR-34a 对DLBCL 细胞增殖、凋亡的影响及其分子机制。

1 材料与方法

1.1 组织来源

收集2019 年1 月至2020 年2 月在四川大学华西医院治疗的50例DLBCL患者为DLBCL组，其中男24 例，女26 例，年龄30～75 岁，平均（50.38±6.18）岁，所有患者术前均未接受放疗、化疗等治疗。同时，选取同期到本院体检的健康志愿者48例为对照组，其中男25 例，女23 例，年龄31～73 岁，平均（52.38±7.06）岁。对照组与DLBCL组性别、年龄等一般资料比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。本研究已取得本院医学伦理委员会批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 试剂

人DLBCL 细胞OCI-Ly8 购自中科院上海细胞库，货号：222476；DMEM 培养基购自美国Hyclone公司，货号：3 332464；胎牛血清（FBS）购自美国Invitrogen 公司，货号：1 986468；胰蛋白酶购自美国BD公司，货号：2 755795；qRT-PCR 试剂盒购自大连宝生物科技，货号：3 138642；四甲基偶氮唑盐比色法（MTT）试剂购自北京天根生化科技有限公司，货号：3 479924；Annexin V-FITC/PI 试剂盒购自上海煊翎生物科技有限公司，货号：22 875467；RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸（BCA）试剂购自中国碧云天生物技术研究所，货号：1766590，277547；兔抗人细胞周期蛋白1（CyclinD1）、P21、B 淋巴细胞瘤-2（Bcl-2）、B 淋巴细胞瘤-2 相关蛋白（Bax）抗体购自购自美国Santa Cruz 公司，货号：1112903，110963，112093，114598；辣根过氧化物酶（HRP）标记的山羊抗兔二抗购自美国Gibco公司，货号：2 668084；MALAT1小分子干扰RNA（si-MALAT1）、乱序无意义阴性序列（si-NC）、miR-34a 寡核苷酸模拟物（miR-34a mimics）及阴性对照mimic NC 序列（miR-NC）、miR-34a特异性寡核苷酸抑制剂（anti-miR-34a）及其阴性对照（anti-miR-NC）购自广州锐博生物科技有限公司，货号：408642576。

1.3 方法

1.3.1 细胞培养和分组 选对数生长期细胞进行实验。分别将si-NC、si-MALAT1、miR-NC、miR-34a mimics 转染至OCI-Ly8 细胞中，记为si-NC 组、si-MALAT1组、miR-NC组、miR-34a组；将si-MALAT1与anti-miR-NC、si-MALAT1 与anti-miR-34a 共转染至OCI-Ly8细胞，记为si-MALAT1+anti-miR-NC组、si-MALAT1+anti-miR-34a 组。转染过程按照Lipofectamine 2000说明书进行操作。

1.3.2 实时荧光定量PCR（qPCR）检测细胞MALAT1和miR-34a表达 采用TRIzol试剂提取细胞总RNA，以RNA 为模板逆转录合成cDNA。按照qPCR 试剂盒的操作步骤进行扩增。分别以GAPDH和U6 为内参照，按照2-ΔΔCt公式计算MALAT1 和miR-34a的相对表达量。引物序列如下。MALAT1，F:5’-GGTCTCTGTGTCTTCGGAG-3’，R:5’-GGAAAACGCCTCAAT-CCCAC-3’；GAPDH，F:5’-CACTGCCAACGTGTCAGTG-3’，R:5’-GACAAAGTGGTCGTTGAGGG-3’；miR-34a，F:5’-TCGGCAGGAACACT GTCTGGTA-3’，R:5’-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3’；U6，F:5’-GCTTCGGCAGCACATATACT-3’，R:5’-GTGCAGGGTCCGAGGTATTC-3’。

1.3.3 MTT 法检测细胞增殖 各组取3×104个/mL的OCI-Ly8 细胞，接种于96 孔板（100 μL/孔），每孔分别加入20 μL 的MTT 溶液，室温孵育4 h，再加入150 μL/孔的二甲基亚砜（DMSO），室温振荡孵育10min，在490nm波长处应用酶标仪检测的OD值。

1.3.4 流式细胞术检测细胞凋亡 取各组OCI-Ly8细胞，预冷的PBS清洗细胞2次，取适量结合缓冲液重悬细胞于流式管内，加入5 μL的Annexin V-FITC，再加入5 μL 的PI 进行染色，避光孵育15 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.3.5 双荧光素酶报告实验检测MALAT1 和miR-34a 的靶向关系 利用LncBase Predicted v.2 预测MALAT1和miR-34a的靶向关系。将WT-MALAT1或MUT-MALAT1 与miR-NC、miR-34a 分别转染至OCI-Ly8细胞，转染48 h后，采用双荧光素酶报告基因实验检测细胞荧光素酶活性。

1.3.6 蛋白质印迹（Western blotting）检测细胞蛋白表达 收集细胞，加入RIPA裂解液在冰上裂解30 min，提取细胞总蛋白，BCA法检测蛋白浓度。取蛋白样品进行SDS-PAGE、转膜、封闭后，加入一抗（1∶1 000稀释），4 ℃冰箱孵育过夜，加入二抗（1∶5 000 稀释），室温孵育2 h，ECL发光液显影。

1.4 统计学方法

采用SPSS 21.0 统计学软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 MALAT1和miR-34a在OCI-Ly8细胞中的表达

与对照组比较，DLBCL 组中MALAT1 表达量明显升高，miR-34a表达量明显降低（P＜0.05），见表1。

表1 MALAT1和miR-34a在OCI-Ly8细胞中的表达

2.2 抑制MALAT1 表达对OCI-Ly8 细胞增殖和凋亡的影响

与si-NC 组比较，si-MALAT1 组细胞MALAT1表达明显降低（P＜0.05）；细胞活力、CyclinD1 蛋白、Bcl-2蛋白表达明显降低（P＜0.05）；细胞凋亡率、P21蛋白、Bax蛋白表达明显升高（P＜0.05），见图1、表2。

图1 OCI-Ly8细胞增殖和凋亡

表2 抑制MALAT1表达对OCI-Ly8细胞增殖和凋亡的影响

表2 抑制MALAT1表达对OCI-Ly8细胞增殖和凋亡的影响

2.3 MALAT1和miR-34a的靶向关系

LncBase Predicted v.2预测MALAT1与miR-34a的结合位点，见图2。与miR-NC组比较，miR-34a组野生型载体WT-MALAT1 的荧光素酶活性明显降低（P＜0.05），而突变型载体MUT-MALAT1 的荧光素酶活性无明显变化（P＞0.05）,见表3。

表3 miR-NC组和miR-34a组野生型载体WT-MALAT1、突变型载体MUT-MALAT1的荧光素酶活性比较

表3 miR-NC组和miR-34a组野生型载体WT-MALAT1、突变型载体MUT-MALAT1的荧光素酶活性比较

图2 MALAT1和miR-34a的靶向关系

2.4 干扰miR-34a可逆转抑制MALAT1对OCI-Ly8细胞增殖和凋亡的影响

与si-MALAT1+anti-miR-NC组比较，si-MALAT1+anti-miR-34a 组细胞活力、CyclinD1、Bcl-2 蛋白表达明显升高（P＜0.05）；细胞凋亡率、P21 蛋白、Bax蛋白表达明显降低（P＜0.05），见图3、表4。

图3 Western blotting检测OCI-Ly8细胞蛋白表达

表4 干扰miR-34a可逆转抑制MALAT1对OCI-Ly8细胞增殖和凋亡的影响

表4 干扰miR-34a可逆转抑制MALAT1对OCI-Ly8细胞增殖和凋亡的影响

3 讨论

DLBCL是血液系统的一种恶性肿瘤，也是NHL的一种，成人最常见的淋巴系统肿瘤，主要指的是细胞核大于2 个正常淋巴细胞的大B 细胞构成的，伴有弥漫生长的肿瘤。常见临床症状是发热、进行性淋巴结肿大和结外肿块[8-9]。LncRNA 靶向miRNA 可以调控肿瘤和癌症的进展，影响其增殖、凋亡、迁移和侵袭。

本实验研究发现，与对照组比较，DLBCL 细胞中MALAT1 表达量明显升高，miR-34a 表达量明显降低。抑制MALAT1 表达，DLBCL 细胞细胞活力明显降低，细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）。有研究发现，在DLBCL组织中MALAT1表达明显升高，下调MALAT1 表达可抑制DLBCL 细胞增殖[10]，与本实验结果一致。黄珊等[11]研究表明，MALAT1 在DLBCL患者中的高表达与多项临床病理参数有关，有望成为判断DLBCL患者预后的标志物。有类似的研究报道，Lnc RNA AK093987在DLBCL中高表达，有可能成为DLBCL 独立的预后肿瘤标志物[12]。李攀等[13]研究发现，LncRNA KCNQ1OT1在DLBCL患者外周血中高表达，并且是DLBCL 患者预后的独立影响因素。

miRNA 是一类长度为20 多个核苷酸的非编码调控RNA，参与细胞增殖、分化、凋亡等一系列生物学过程。研究表明，miRNA 直接参与了DLBCL 的发生、发展。武君等[14]研究结果显示，miR-34a通过靶向FOXP1 表达，进而促进DLBCL 细胞凋亡。类似的研究结果表明，miR-215在DLBCL患者病理组织中低表达，miR-215 靶向抑制KDM1B 表达，抑制DLBCL细胞增殖，促进细胞的凋亡[15]。闻淑娟等[16]研究显示，下调miR-9 通过靶向FOXP1 促进DLBCL 细胞的增殖和侵袭。王馨瑗[17]研究发现，血清miR-155、miR-15a、miR-16-1 与DLBCL 近期疗效，临床分期密切相关，有望成为DLBCL 新一代肿瘤标记物。

本实验结果表4证明，细胞活力明显升高，细胞凋亡率明显降低（P＜0.05），说明干扰miR-34a可逆转抑制MALAT1 对DLBCL 细胞增殖和凋亡的影响。LncRNA 与DLBCL 关系的联系十分密切[18]。已经文献报道，LncRNA SNHG8通过海绵miR-335-5p促进DLBCL的增殖并抑制其凋亡[19]。

综上所述，MALAT1在DLBCL细胞中高表达，miR-34a在DLBCL细胞中低表达，抑制MALAT1通过上调miR-34a表达抑制DLBCL细胞增殖，促进凋亡，为该疾病的治疗提供理论依据。