circ-EIF4G3负调控miR-17-5p对非小细胞肺癌细胞的增殖、细胞周期和凋亡的影响

夏 奎，王 安，钟昌秀

（1.博鳌超级医院胸心外科，琼海 571400；2.琼海市人民医院胸心外科，琼海 571400）

肺癌是世界范围内与癌症相关死亡的主要原因，非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）约占所有肺癌患者的85%。目前，尽管诊断技术和治疗策略取得了巨大进步，但NSCLC 患者的预后仍然较差，且患者的总体5 年生存率仅为10%[1]。早期发现率低是导致高发病率和高死亡率的主要原因之一[2]。因此，探索NSCLC的新型治疗靶点对改善患者预后，提高患者生存率至关重要。环状RNA（circular RNAs，circRNA）是由外显子反向剪接形成的非编码RNA分子，circRNA与人类癌症的发展密切相关，包括NSCLC[3-4]。最近研究发现，circ-EIF4G3在NSCLC中表达上调，并可能参与NSCLC 发生过程[5]。但是，circ-EIF4G3 在NSCLC中的作用机制仍不清楚。微小RNA（microRNA，miRNA）是另一组内源性非编码RNA，先前研究表明，circRNA 可通过充当miRNA 海绵发挥作用[6]。Wang等[7]研究显示，circ-EIF4G3通过海绵吸附miR-335 促进胃癌的增殖、侵袭和迁移。但是，circ-EIF4G3 及其靶miRNA 在NSCLC 进展中的作用仍不清楚。本研究旨在探讨circ-EIF4G3在NSCLC肿瘤发生中的功能及分子机制，以期为NSCLC 的诊断和治疗提供新的生物标志物和靶标。

1 材料与方法

1.1 细胞和主要试剂

人非小细胞肺癌细胞系（NCI-H1299、NCIH520和NCI-H460）和人正常肺上皮细胞系（BEAS-2B）由中国科学院上海细胞库提供；DMEM 高糖培养基由美国Gibco 公司提供；胎牛血清由南京凯基生物科技有限公司提供；Lipofectamine 3000脂质体转染试剂由美国Invitrogen 公司提供；circ-EIF4G3 siRNA 和siRNA 对照、miR-17-5p mimics 和mimics对照由广州锐博生物科技有限公司提供；CCK-8试剂由日本同仁化学研究所提供；Trizol试剂、逆转录试剂盒和SYBR Green qPCR 检测试剂盒由赛默飞世尔科技有限公司提供；引物由上海生工生物工程有限公司提供；Annexin V-FITC/PI双染色细胞凋亡检测试剂盒由大连宝生物工程有限公司提供；双荧光素酶报告系统检测试剂盒由上海翊圣生物科技有限公司提供；circ-EIF4G3-Wt 和circ-EIF4G3-Mut重组载体质粒由上海吉玛制药技术有限公司提供；Cleaved Caspase-3单克隆抗体和二抗由美国CST公司提供；Western blotting 检测所需试剂由碧云天生物技术研究所提供。

1.2 细胞培养和转染

BEAS-2B、NCI-H1299、NCI-H520 和NCI-H460细胞培养在含10%胎牛血清、1%青霉素—链霉素的DMEM 培养基中，放置在常规细胞培养箱中，培养条件：5%CO2，37 ℃，饱和湿度。当细胞融合至90%左右时，使用0.25%的胰蛋白酶消化细胞并传代培养，取对数期的细胞进行实验。取对数生长期的NCI-H1299细胞接种到6孔板中，过夜培养，待细胞生长汇合度在50%左右时进行转染，转染circ-EIF4G3 siRNA的NCI-H1299细胞记为转染（si-circ-EIF4G3）组，转染siRNA 对照的NCI-H1299 细胞记为转染对照（si-NC）组，其中未行转染的NCI-H1299细胞记为空白对照（Mock）组。具体转染步骤严格按照Lipofectamine 3000转染试剂使用说明进行，转染6 h 时更换成正常培养液，48 h 后收集各组NCIH1299细胞，进行相关指标的检测。

1.3 qPCR检测

BEAS-2B、NCI-H1299、NCI-H520 和NCI-H460细胞以及转染48 h 后的各组NCI-H1299 细胞分别采用Trizol试剂提取总RNA，分别测定RNA样品的浓度和纯度，取合格的RNA 进行逆转录，具体步骤参照逆转录试剂盒进行操作。以合成的cDNA为模板，使用SYBR Green qPCR 检测试剂盒行qPCR 检测，反应程序为：95 ℃预变性5 min，随后设40个循环：95 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸15 s。以GAPDH 为内参，分析circ-EIF4G3 的相对表达量，以U6 为内参，分析miR-17-5p 的相对表达量。每组实验重复3 次。采用相对定量2-ΔΔCt法进行定量。qPCR 所用引物序列为，GAPDH，F：5’-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3’；R 5’-ATGGCATGG ACTGTGGTCAT-3’。circ-EIF4G3，F：5’-CCTACCCCATCCCCTTATTC-3’；R：5’-ACCGTGCTGTAGACTGCTGAG-3’。U6，F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。miR-17-5p，F：5’-CCAGGATCCTTTATAGTTGTTAGAGTTT-3’；R：5’-CGGAATTCTAATCTACTTCACTATCTGCAC-3’。

1.4 CCK-8实验

将对数期NCI-H1299细胞铺板96孔板，分组转染48 h时检测细胞增殖活力，即向每孔细胞中加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育2 h，弃上清，使用全自动酶标仪测定490 nm 处各孔细胞吸光度（A）值。每组实验重复3次。

1.5 流式细胞术检测

收集转染48 h 后的NCI-H1299 细胞，调整细胞浓度为1×105个/mL，向细胞中加入预冷的75%的乙醇，于4 ℃冰箱固定12 h，使用PBS 洗涤细胞，加入适量核糖核酸酶，37 ℃避光水浴30 min，随后加入PI 染液，避光孵育5 min，使用流式细胞仪检测细胞周期分布。每组实验重复3次。

1.6 Annexin V-FITC/PI双染色法检测

NCI-H1299 细胞转染48 h 后，加入胰蛋白酶消化并收集细胞，向细胞中加入400 μL结合缓冲液重悬细胞，再向细胞悬液中依次添加Annexin V-FITC和PI各5 μL，轻轻分混匀，室温下避光反应15 min，立即上流式细胞仪，检测细胞凋亡情况，检测结果以Cell Quest软件分析细胞凋亡率。每组实验重复3次。

1.7 Western blotting检测

收集转染48 h 后的各组NCI-H1299 细胞，加入细胞裂解液，放置在冰上裂解15 min，离心取上清即为总蛋白，采用BCA蛋白定量检测试剂盒测定蛋白浓度，取40 μg 蛋白样品进行SDS-PAGE 电泳，待蛋白分离后电转至PVDF 膜上，室温封阻2 h。加入1∶1 000 稀释的Cleaved Caspase-3 单克隆抗体，4 ℃过夜孵育，次日加入1∶2 000稀释的二抗，室温孵育2 h，滴加ECL 化学发光液进行显影，在暗室使用凝胶成像系统采集图像，采用Imag J 软件分析条带灰度值，以GAPDH 进行标定，计算Cleaved Caspase-3相对表达水平。每组实验重复3次。

1.8 双荧光素酶报告基因实验

根据生物信息学预测结果，扩增circ-EIF4G3和miR-17-5p 结合位点和突变位点序列，并插入荧光素酶报告载体上，分别构建circ-EIF4G3-Wt 和circ-EIF4G3-Mut 重组载体质粒。使用Lipofectamine 3000 转染试剂将circ-EIF4G3-Wt 和circ-EIF4G3-Mut重组载体质粒分别和miR-17-5p mimics或mimics 对照共转染NCI-H1299 细胞，48 h 后收集细胞，并使用双荧光素酶报告系统检测试剂盒测定海肾和萤火虫荧光素酶活性，分别计算细胞的相对荧光素酶活性。每组实验重复3次。

1.9 统计学分析

采用SPSS 21.0 软件进行数据统计分析，计量资料以均数±标准差（）表示，两组均数比较采用t检验，多组比较采用单因素方差分析，两两比较采用SNK-q检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circ-EIF4G3 和miR-17-5p 在NSCLC 细胞中的表达

与人正常肺上皮细胞系BEAS-2B 相比，人NSCLC 细胞系NCI-H1299、NCI-H520 和NCI-H460中circ-EIF4G3 的表达水平显著升高（P＜0.05），而miR-17-5p 的表达水平显著降低（P＜0.05），见表1。circ-EIF4G3在NCI-H1299细胞中基础表达量最高，因此，选择NCI-H1299细胞用于后续实验。

表1 circ-EIF4G3 和miR-17-5p 在NSCLC 各细胞系中的相对表达水平比较，n=3

表1 circ-EIF4G3 和miR-17-5p 在NSCLC 各细胞系中的相对表达水平比较，n=3

与BEAS-2B细胞系相比，*P＜0.05。

2.2 抑制circ-EIF4G3 对NCI-H1299 细胞增殖活力的影响

与Mock 组和si-NC 组相比，si-circ-EIF4G3 组NCI-H1299 细胞中circ-EIF4G3 的表达水平显著降低（P＜0.05）；Mock 组和si-NC 组相比，NCI-H1299细胞中circ-EIF4G3 的表达水平差异不明显（P＞0.05）。与Mock 组和si-NC 组相比，si-circ-EIF4G3组NCI-H1299 细胞增殖活力显著降低（P＜0.05）；Mock 组和si-NC 组相比，NCI-H1299 细胞增殖活力差异不明显（P＞0.05），见表2。

表2 各组NCI-H1299 细胞增殖活力和circ-EIF4G3 相对表达量比较，n=3

表2 各组NCI-H1299 细胞增殖活力和circ-EIF4G3 相对表达量比较，n=3

与Mock组相比，*P＜0.05；与si-NC组相比，&P＜0.05。

2.3 抑制circ-EIF4G3 对NCI-H1299 细胞周期的影响

与Mock 组和si-NC 组相比，si-circ-EIF4G3 组G0/G1期细胞比例显著增多（P＜0.05），而S 期和G2/M期细胞比例随之减少（P＜0.05）；Mock组和si-NC组相比，G0/G1期、S 期和G2/M 期细胞比例差异不明显（P＞0.05），见表3。

表3 各组G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例比较，n=3

表3 各组G0/G1期、S期和G2/M期细胞比例比较，n=3

与Mock组相比，*P＜0.05；与si-NC组相比，&P＜0.05。

2.4 抑制circ-EIF4G3 对NCI-H1299 细胞凋亡的影响

与Mock 组和si-NC 组相比，si-circ-EIF4G3 组NCI-H1299细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3的表达水平明显升高（均P＜0.05）；Mock 组和si-NC 组相比，细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3 的表达水平差异不明显（P＞0.05），见图1和表4。

表4 各组NCI-H1299细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3的表达水平比较，n=3

表4 各组NCI-H1299细胞凋亡率和Cleaved Caspase-3的表达水平比较，n=3

与Mock组相比，*P＜0.05；与si-NC组相比，&P＜0.05。

图1 抑制circ-EIF4G3对NCI-H1299细胞凋亡的影响

2.5 circ-EIF4G3靶向调控miR-17-5p关系验证

生物信息学Starbase 在线数据库预测结果显示，circ-EIF4G3 和miR-17-5p 间存在靶向结合位点。与miR-NC 组相比，过表达miR-17-5p 的circ-EIF4G3-Wt 细胞相对荧光素酶活性显著降低（P＜0.05），而过表达miR-17-5p的circ-EIF4G3-Mut细胞相对荧光素酶活性差异不明显（P＞0.05）。与Mock组和si-NC 组相比，si-circ-EIF4G3 组NCI-H1299 细胞中的miR-17-5p表达水平明显降低（均P＜0.05）；Mock 组和si-NC 组相比，miR-17-5p 的表达水平差异不明显（P＞0.05），见图2和表5。

表5 各组NCI-H1299细胞中miR-17-5p表达水平比较，n=3

表5 各组NCI-H1299细胞中miR-17-5p表达水平比较，n=3

与Mock组相比，*P＜0.05；与si-NC组相比，&P＜0.05。

图2 circ-EIF4G3和miR-17-5p靶向关系验证

3 讨论

circRNA 是一类新的广泛存在的内源性RNA。circRNA具有两个最重要的特性即它们高度保守且非常稳定，这些优点使circRNA 具有成为癌症诊断的理想生物标志物的潜力[8]。circRNA 报道最多的功能模式是充当miRNA 海绵。这种“海绵状”特征类似于长非编码RNA（lncRNA），这表明circRNA是与miRNA结合作为miRNA的分子吸收剂发挥调控作用。例如，circ-MYBL2 作为miR-361-3p 的海绵，可促进宫颈癌细胞的增殖和侵袭[9]。在前列腺癌中，circ-MTO1与患者良好的预后相关，并能够通过靶向抑制miR-17-5p表达抑制前列腺癌细胞的增殖和侵袭[10]。在NSCLC 中，circ-CMPK1 通过海绵吸附miR-302e 来增加细胞周期蛋白D1 的表达，从而促进NSCLC细胞增殖[11]。NSCLC是最常见的肺部恶性肿瘤，其特征是肺组织中细胞的增殖不受控制[12]。近年来，基因芯片技术已公开了许多与NSCLC 相关的circRNA[13]。先前的研究表明，circRNA 参与了一系列涉及NSCLC 肿瘤发生和发展的生理过程[14-15]。在以往研究中，与匹配的非癌组织和正常肺16HBE细胞相比，在肺癌患者标本组织和肺癌细胞中circ-EIF4G3表达被证实过表达[5]。本实验的数据同样证实了circ-EIF4G3在NSCLC细胞系中的表达上调，这意味着circ-EIF4G3可能是肺癌中的一种癌基因。

既然已验证circ-EIF4G3 在肺癌组织和肺癌细胞中上调表达，则进一步的功能实验对于验证其他生物学效应是必要的。体外试验揭示了抑制circ-EIF4G3 能够阻碍NSCLC 细胞增殖和细胞周期进程，并促进细胞凋亡。Caspase-3是细胞凋亡过程中终末剪切酶，在细胞凋亡中扮演重要角色[16]。Caspase-3 激活水平在一定程度上反映细胞凋亡程度。本实验结果发现，抑制circ-EIF4G3后NCI-H1299细胞中Cleaved Caspase-3 的表达水平显著升高，表明抑制circ-EIF4G3 可通过上调Cleaved Caspase-3 的表达促进NCI-H1299 细胞凋亡。因此，发现circ-EIF4G3具有NSCLC致癌作用，为NSCLC的治疗提供了有价值的标志物。此外，本实验还发现，与circ-EIF4G3 的表达水平相反，miR-17-5p 在NSCLC细胞系中的表达显著降低，且抑制circ-EIF4G3能够促进miR-17-5p的表达。笔者推测circ-EIF4G3可能通过调控miR-17-5p 的表达参与NSCLC 的发展。在各种类型的癌症（包括甲状腺癌、结直肠癌和前列腺癌）中，miR-17-5p 的表达均下调，发挥抑癌基因的作用[17-19]。多项研究已证实，miR-17-5p 在NSCLC 组织和细胞系中显著降低，且miR-17-5p 过表达明显抑制细胞增殖，同时诱导细胞凋亡[20-22]。本实验生物信息学软件预测结果显示，circ-EIF4G3和miR-17-5p 存在靶向结合位点，表明circ-EIF4G3和miR-17-5p之间可能存在靶向关系。后续通过双荧光素酶报告基因实验和qPCR 技术证实，circ-EIF4G3 能够负向调控miR-17-5p 的表达。以上的实验结果，证明了circ-EIF4G3 通过海绵miR-17-5p在NSCLC中起致癌作用。

综上，circ-EIF4G3在NSCLC中表达上调，抑制circ-EIF4G3通过调节miR-17-5p抑制NCI-H1299细胞增殖和细胞周期进程，并诱导细胞凋亡，在NSCLC中起癌基因的作用。本研究结果表明，miR-17-5p作为NSCLC的预后预测因子和治疗靶标可能具有较大的潜力。