PRMT1通过调控ZEB1对高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和上皮—间充质转化的影响*

李海玲，董陆玲，杨亚萍，杨秀红，张贵山

（张家口市第一医院 1.内分泌科，2.呼吸科，张家口 075000）

糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症之一，是终末期肾病的主要原因。目前，糖尿病肾病患者数约占终末期肾病患者的50%[1]。在糖尿病肾病的发展过程中，肾功能的下降与肾纤维化的程度密切相关，尤其是肾小管间质纤维化[2]。肾小管上皮细胞损伤诱导的细胞上皮—间充质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被认为是导致肾纤维化的关键因素[3]。但糖尿病中肾小管上皮细胞EMT 的详细分子机制尚不明确。蛋白质精氨酸甲基转移酶-1(protein arginine methyltranferase-1，PRMT1)可控制多种底物基因的表达，并调节正常生理和病理发育过程中的一系列生物学进程[4]。已有研究表明，高糖可诱导糖尿病肾病小鼠足细胞中PRMT1表达上调。抑制PRMT1表达可减轻足细胞凋亡和EMT，从而改善糖尿病肾病小鼠足细胞损伤[5]。PRMT1 的主要下游底物可能涉及EMT 信号通路的几个关键成分，如锌指蛋白SNAⅠ1(zinc finger protein SNAⅠ1，Snail)、锌指蛋白SNAⅡ(zinc finger protein SNAⅡSLUG)、扭曲相关蛋白1(twistrelated protein 1，Twist1)和锌指E 盒结合同源框1(zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)[6]。目前，已有证据显示，PRMT1 可通过上调ZEB1 表达调节人类乳腺癌细胞EMT 和衰老[7]。然而，目前还不清楚PRMT1 是否通过调控ZEB1 表达在糖尿病肾病EMT 中发挥作用。因此，本研究旨在探究PRMT1 是否通过调控ZEB1 表达在高糖诱导的肾小管上皮细胞凋亡和EMT中发挥作用，以期为明确糖尿病中肾小管上皮细胞EMT 的详细分子机制及开发新的糖尿病肾病治疗靶点提供新的依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料

人肾小管上皮细胞系HK-2购自中国科学院细胞库；siRNA 阴性对照（si-NC）、过表达载体阴性对照（oe-NC）、PRMT1 特异性siRNA（si-PRMT1）、ZEB1 过表达载体（oe-ZEB1）购自苏州泓迅生物科技有限公司；Lipofectamine 2000转染试剂购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司；CCK-8 检测试剂盒购自吉满生物科技(上海)有限公司；Annexin V FITC/PI 凋亡检测试剂盒购自北京索莱宝科技有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix购自美国Bimake；PRMT1、ZEB1 和GAPDH 抗体购自英国Abcam 公司；E-cadherin、Fibronectin 和α-SMA 抗体购自美国Santa Cruz Biotechnology；SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP 试剂盒购自美国Cell Signaling Technology。

1.2 细胞培养及高糖处理

取出冻存的HK-2细胞，37 ℃水浴快速解冻，离心收集细胞。用含10%FBS、100 U/mL青链霉素的DMEM培养基重悬细胞，并将冻存管内的细胞转移至培养皿内。将盛有细胞的培养皿放入37 ℃、5%CO2培养箱内培养。待细胞密度达到80%～90%时，用0.25%胰酶液消化细胞。将细胞接种于6 孔板内，1×105个/孔，细胞继续培养24 h 后，将细胞随机分为空白对照组和高糖组，对照组细胞用含2%FBS、葡萄糖5.5 mmol/L 的DMEM 培养基培养，高糖组细胞用含2%FBS、葡萄糖30 mmol/L的DMEM培养基培养。

1.3 细胞分组及转染

将对数期生长的HK-2细胞接种于6孔板中，2×105个/孔，细胞继续培养24 h后，将细胞随机分为空白对照组（正常培养且无转染处理）、si-NC组（转染si-NC）和si-PRMT1组（转染si-PRMT1）或者是空白对照组（正常培养且无转染处理）、si-NC+oe-NC 组（转染si-NC 和oe-NC）、si-PRMT1+oe-NC 组（转染si-PRMT1和oe-NC）、si-NC+oe-ZEB1组（转染si-NC和oe-ZEB1）、si-PRMT1+oe-ZEB1组（转染si-PRMT1和oe-ZEB1），根据分组，按照Lipofectamine 2000 转染试剂说明书所示，将si-NC、oe-NC、si-PRMT1、oe-ZEB1 转染至细胞中。细胞继续培养48 h 后，将各组细胞培养基更换为含2%FBS、葡萄糖30 mmol/L的DMEM培养基培养继续培养48 h后，进行后续实验操作。

1.4 CCK-8检测细胞增殖

将对数期生长的HK-2 细胞或者是转染后的HK-2细胞接种于96孔板中，5×103个/孔。细胞继续培养24 h 后，将HK-2 细胞分为空白对照组和高糖组，将转染后的HK-2细胞分为空白对照组、si-NC+oe-NC组、si-PRMT1+oe-NC组、si-NC+oe-ZEB1组、si-PRMT1+oe-ZEB1组，按照“1.2”项和“1.3”项所述进行细胞处理。细胞继续培养24 h、48 h和72 h后，向细胞中添加CCK-8溶液（10 μL/孔），细胞于37 ℃培养箱中静置孵育4 h后，用酶标仪测定每孔在450 nm处的光密度（OD）值。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

收集HK-2 细胞，向细胞中添加预冷PBS 清洗细胞，共清洗2次。重新收集细胞，向细胞中加入1×结合缓冲液重悬细胞沉淀，并将细胞密度调整为1×106个/mL。取上述细胞悬液100 μL，向细胞中添加5 μL FITC-Annexin V 和5 μL PI 工作液，充分混匀后，将细胞置于室温条件下避光孵育15 min。向细胞中加入400 μL 1×结合缓冲液，充分混匀后，立即用流式细胞仪检测。

1.6 qRT-PCR 检测细胞PRMT1 和ZEB1 mRNA 表达

收集HK-2细胞，Trizol法提取细胞RNA。微量分光光度计测定RNA 的纯度及浓度，随后将RNA逆转录，得到cDNA。按照2× SYBR Green qPCR Master Mix 说明书所示，进行qRT-PCR 实验。反应程序：95 ℃、1 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40 个循环；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。实验中所需引物序列，见表1。以GAPDH 为内参，采用2-ΔΔCt法计算PRMT1和ZEB1 mRNA相对表达量。

表1 qRT-PCR实验所需引物序列

1.7 Western blotting 检测细胞PRMT1、ZEB1、Ecadherin、Fibronectin和α-SMA蛋白表达

收集HK-2 细胞，加入含有苯甲基磺酰氟的蛋白裂解液，冰上裂解细胞沉淀。离心收集裂解上清液并对其进行浓度的测定。根据所测浓度，取30 μg蛋白加至凝胶上样孔内，进行SDS-PAGE 凝胶电泳。电泳结束后，进行转膜操作。5%脱脂奶粉室温孵育2 h，去除非特异性结合位点。分别加入PRMT1（1∶2 000）、ZEB1（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）、Fibronectin（1∶2 000）、α-SMA（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）抗体稀释液，置于4 ℃条件下，摇床孵育过夜。加入特异性二抗（1∶5 000）抗体稀释液，室温条件下摇床孵育1 h。均匀涂抹ECL 发光液，凝胶成像系统检测蛋白条带，Image J 软件分析各蛋白条带的灰度值。

1.8 CHIP-PCR 和CHIP-qPCR 实验检测PRMT1 对ZEB1启动子的调控作用

弃去HK-2细胞培养基，加入1%甲醛于37 ℃条件下孵育10 min，冰上终止固定，预冷PBS 清洗细胞。将细胞收集于离心管内。加入SDS 裂解缓冲液重悬细胞沉淀，冰上反应10 min，超声剪切染色质DNA，获得200～1 000 bp 的染色质片段。超声破碎后的产物用5 mol/L的NaCl解交联。离心收集上清液，根据SimpleChIP® Plus Sonication Chromatin IP 试剂盒说明书进行后续实验操作。向上清液中添加CHIP 缓冲液和蛋白酶抑制剂混合物，再加入蛋白A琼脂糖珠，4 ℃条件下摇床孵育1 h。离心收集上清液，将上清液平均分为3 组：Input 组、IgG 组和PRMT1 组，根据分组，分别加入Histone H3、IgG和PRMT1 抗体，在4 ℃摇床轻柔摇动过夜。加入蛋白A琼脂糖珠4 ℃摇床孵育1 h，以形成抗体—蛋白A 免疫复合物。离心收集沉淀，用低、高盐洗涤液、LiCl 洗涤液、TE Buffer 依次洗涤沉淀。加入200 μL洗脱缓冲液洗涤沉淀，离心收集上清。加入20 μL 5 mol/L 的NaCl 解交联。随后加入10 μL 0.5 mol/L EDTA、20 μL 1 mol/L Tris-HCl（pH=6.5）、2 μL 10 mg/mL 蛋白酶K，45 ℃条件下孵育10 min。按照胶回收试剂盒说明书回收DNA 片段。以回收的DNA 为模板，用PCR 扩增法检测ZEB1 启动子DNA，PCR 产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测。另外，以回收DNA 为模板进行qPCR 实验。ZEB1 上游引物：5’-CCAAAATGGAGGGCTCAACA-3’；ZEB1下游引物：5’-AATGTGGCTGATTATTTGGC-3’。

1.9 统计学方法

采用SPSS 21.0 软件进行数据统计分析。数据以均值±标准差（）表示，两组间比较采用独立样本t检验；多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 高糖对HK-2细胞增殖、凋亡和EMT的影响

与空白对照组相比，高糖组细胞增殖能力明显降低（P＜0.05），细胞凋亡率明显升高（P＜0.05），Ecadherin蛋白相对表达量明显降低（P＜0.05），而Fibronectin 和α-SMA 蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05），见图1。

图1 高糖对HK-2细胞增殖、凋亡和EMT的影响

2.2 高糖对HK-2细胞中PRMT1和ZEB1表达的影响

与空白对照组相比，高糖组细胞中PRMT1 和ZEB1 mRNA 相对表达水平明显升高（P＜0.05），PRMT1 和ZEB1 蛋白相对表达量明显升高（P＜0.05），见图2。

图2 高糖对HK-2细胞中PRMT1和ZEB1表达的影响

2.3 PRMT1 通过与ZEB1 启动子区域结合调控ZEB1的表达

与空白对照组相比，si-NC 组细胞中PRMT1 和ZEB1 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与si-NC 组相比，si-PRMT1 组细胞中PRMT1 和ZEB1 蛋白表达明显降低（P＜0.05）（图3A）。Consite（http://consite.genereg.net/）和JASPAR（http://jaspar.binf.ku.dk/）软件分析ZEB1 启动子区域潜在的PRMT1结合位点，CHIP-PCR 实验检测PRMT1 对ZEB1 启动子的调控作用，结果显示，PRMT1组和Input组含有ZEB1 被扩增区段DNA，而阴性对照IgG 组没有（图3B）。与IgG组相比，PRMT1组ZEB1启动子区域（-327至-179 bp）明显富集（P＜0.05）（图3C）。

图3 PRMT1通过与ZEB1启动子区域结合调控ZEB1的表达

2.4 si-PRMT1 和oe-ZEB1 对HK-2 细胞中PRMT1和ZEB1表达的影响

与空白对照组相比，si-NC+oe-NC 组细胞中PRMT1 和ZEB1 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；与si-NC+oe-NC组相比，si-PRMT1+oe-NC组细胞中PRMT1 和ZEB1 蛋白表达明显降低（均P＜0.05），si-NC+oe-ZEB1 组细胞中PRMT1 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），ZEB1 蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与si-PRMT1+oe-NC 组相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 组细胞中PRMT1 蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05），ZEB1 蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与si-NC+oe-ZEB1 组相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 组细胞中PRMT1 蛋白表达明显降低（P＜0.05），ZEB1蛋白表达明显降低（P＜0.05），见图4。

图4 si-PRMT1和oe-ZEB1对HK-2细胞中PRMT1和ZEB1表达的影响

2.5 PRMT1/ZEB1 轴对HK-2 细胞增殖和凋亡的影响

高糖处理各组细胞，结果显示，与空白对照组相比，si-NC+oe-NC组细胞增殖能力和细胞凋亡率差异无统计学意义（P＞0.05）；与si-NC+oe-NC组相比，si-PRMT1+oe-NC 组细胞增殖能力明显升高（P＜0.05），细胞凋亡率明显降低（P＜0.05），si-NC+oe-ZEB1组细胞增殖能力明显降低（P＜0.05），细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；与si-PRMT1+oe-NC 组相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 组细胞增殖能力明显降低（P＜0.05），细胞凋亡率明显升高（P＜0.05）；与si-NC+oe-ZEB1组相比，si-PRMT1+oe-ZEB1组细胞增殖能力明显升高（P＜0.05），细胞凋亡率明显降低（P＜0.05），见图5。

图5 PRMT1/ZEB1轴对HK-2细胞增殖和凋亡的影响

2.6 PRMT1/ZEB1轴对HK-2细胞EMT的影响

高糖处理各组细胞，结果显示，与空白对照组相比，si-NC+oe-NC 组细胞中E-cadherin、Fibronectin 和α-SMA 蛋白表达差异无统计学意义（均P＞0.05）；与si-NC+oe-NC组相比，si-PRMT1+oe-NC组细胞E-cadherin 蛋白表达明显升高（P＜0.05），Fibronectin 和α-SMA 蛋白表达明显降低（P＜0.05），si-NC+oe-ZEB1 组细胞E-cadherin 蛋白表达明显降低（P＜0.05），Fibronectin和α-SMA蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与si-PRMT1+oe-NC 组相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 组细胞E-cadherin 蛋白表达明显降低（P＜0.05），Fibronectin和α-SMA蛋白表达明显升高（P＜0.05）；与si-NC+oe-ZEB1 组相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 组细胞E-cadherin 蛋白表达明显升高（P＜0.05），Fibronectin和α-SMA蛋白表达明显降低（P＜0.05）。见图6。

图6 PRMT1/ZEB1轴对HK-2细胞EMT的影响

3 讨论

糖尿病肾病已经成为人类一个主要的公共卫生问题，给个人、家庭和社会带来了巨大的经济负担[8]。肾小管上皮细胞EMT被认为是糖尿病肾病肾小管间质纤维化形成的关键过程。尽管已有多种信号通路或介质在体外或体内调控肾小管上皮细胞转化或纤维化形成，但糖尿病诱导肾小管上皮细胞转化的详细分子机制尚不完全清楚[9]。鉴于EMT在糖尿病肾病肾组织损伤发展过程中的致病作用，阐明导致糖尿病肾病肾纤维化的相关分子机制对于确定治疗靶点是至关重要的。

EMT在纤维化的发展过程中起着重要作用，上皮细胞处于特定的生理或病理情况下，可激活一系列信号转导途径，抑制上皮细胞上皮相关蛋白(Ecadherin)表达，促使间充质标志物(Fibronectin 和α-SMA)表达增加，最终获得具有侵袭能力的间充质表型，从而产生更多的成纤维细胞样细胞[10]。PRMTs家 族由Ⅰ型PRMTs(PRMT1、PRMT 2、PRMT 3、PRMT 4、PRMT 6 和PRMT 8) 和Ⅱ型PRMTs(PRMT5和PRMT9)组成。其中PRMT1已被证实参与调控乳腺癌细胞EMT 过程。此外，PRMT1 可促进心外膜侵袭和EMT过程，是调节心室形态发生和冠状动脉形成的重要因子[11]。PRMT1 还可促进糖尿病高血糖，在生理和病理条件下可调节糖异生和介导葡萄糖稳态，肝脏特异性PRMT1 缺乏可明显改善糖尿病高血糖[12]。已有研究表明，棕榈酸盐可上调PRMT1 表达，敲低PRMT1 可明显抑制棕榈酸盐诱导的肾小球系膜细胞凋亡和内质网应激[13]。Chen等[14]的研究结果显示，糖尿病肾病患者血清中PRMT1的水平和糖尿病肾病小鼠肾组织中PRMT1的表达明显升高。高糖可诱导体外培养的肾小管细胞中PRMT1表达增加。敲低PRMT1可抑制高糖诱导的肾小管细胞内质网应激、细胞凋亡和EMT。肾脏细胞在高糖等损伤性刺激后的表型转化在糖尿病肾病的进展中起着至关重要的作用[15]，本研究用含葡萄糖30 mmol/L 的DMEM 培养基培养HK-2细胞，结果显示，高糖可抑制HK-2 细胞增殖，诱导细胞凋亡，促进细胞EMT。此外，高糖还可促进HK-2 细胞中PRMT1 的表达，而敲低PRMT1 后，可促进HK-2 细胞增殖，抑制细胞凋亡和EMT。该研究结果与Chen等[14]的研究结果一致，表明高糖诱导的PRMT1表达可促进糖尿病肾病疾病进展。

PRMT1 是催化蛋白质精氨酸甲基化过程的关键酶，其甲基化底物蛋白包括组蛋白H4 和非组蛋白FOXO1、ERα、MRE11 和53BP1 等[16]。PRMT1 甲基化组蛋白H4R3 发生非对称性二甲基化（H4R3me2as），进而激活ZEB1 的表达。ZEB1 位于人类染色体10p11.22 上，是PRMT1 所介导的EMT及其相关功能的关键转录因子。ZEB1 可以通过EMT 促进细胞增殖、迁移和胶原形成，最终诱导纤维化[17]。已有研究表明，ZEB1参与肝纤维化疾病进展，果糖通过上调ZEB1表达促进EMT，从而诱导肝纤维化[18]。ZEB1 介导的人肺泡上皮Ⅱ型细胞中的EMT通过旁分泌信号传递给潜在的成纤维细胞，促进了肺纤维化的发展。靶向ZEB1可能是治疗肺纤维化的一个可行的策略[19]。Tang等[20]的研究结果显示，高糖刺激可诱导HK-2 细胞中ZEB1 的表达，促进细胞EMT。敲低ZEB1 表达可逆转高糖诱导的EMT。此外，目前已有证据显示，在胰腺癌中，PRMT1通过与ZEB1启动子区域结合上调ZEB1的表达，从而促进胰腺癌细胞增殖和侵袭[21]。本研究结果显示，高糖刺激可诱导HK-2细胞中ZEB1的表达，进一步抑制细胞增殖，促进细胞凋亡和EMT。敲低PRMT1 后，HK-2 细胞中ZEB1 的表达下调，而过表达ZEB1对HK-2细胞中PRMT1表达无明显影响。进一步实验结果表明，过表达ZEB1 可逆转敲低PRMT1对高糖诱导的HK-2细胞的影响，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡和EMT。敲低PRMT1 则可逆转过表达ZEB1对高糖诱导的HK-2细胞的影响，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡和EMT。表明高糖诱导的PRMT1 通过上调ZEB1 表达促进糖尿病肾病疾病进展。

综上所述，高糖刺激可抑制HK-2细胞增殖，促进细胞凋亡和EMT，上调PRMT1 和ZEB1 表达。PRMT1通过与ZEB1启动子区域结合上调ZEB1的表达，从而抑制高糖刺激的HK-2细胞增殖，促进细胞凋亡和EMT。本研究结果为明确糖尿病肾病肾纤维化的相关分子机制及开发新的治疗靶点提供了新的依据。