LncRNA SNHG3通过调控miR-410-3p对脓毒症血管内皮细胞增殖、凋亡的影响*

宋 蕾，张建国，刘英勋

（山东省青岛市城阳区人民医院重症医学科，青岛 266109）

脓毒症主要是由感染引发的全身炎症反应的综合征，是ICU 常见的一种疾病，感染源主要有真菌、病毒、细菌和寄生虫等，严重时可引发休克或死亡，病死率高达30%[1-2]。据统计，每年超过3 000万人次确诊为脓毒症，其发病机制较为复杂，可导致心、肝、肾等重要器官损伤[3-4]。脂多糖（LPS）是革兰阴性细菌感染疾病的主要因素，也常用于诱导建立脓毒症细胞模型[5]。长链非编码RNA（lncRNA）小核仁RNA 宿主基因3（SNHG3）在多种疾病中异常表达，位于染色体1p35.3上，与多种疾病的增殖、凋亡等生物学过程密切相关[6]。Zhang等[7]研究结果显示，SNHG3在缺氧和葡萄糖剥夺诱导脑微血管内皮细胞（BMVEC）中高表达，利用干扰shRNA技术，沉默SNHG3 可以明显抑制葡萄糖剥夺诱导脑微血管内皮细胞BMVEC 的增殖、转移，诱导其细胞凋亡，但是在脓毒症的研究尚不明确。miRNA 可以作为脓毒症的潜在生物标志物，如miR-25、miR-133a、miR-146、miR-150 和miR-223 等，与疾病的分期、预后有关[8]。有研究发现，miR-410-3p 在LPS 诱导的小鼠心肌细胞中低表达，miR-410-3p 通过抑制TLR2减缓脓毒症心肌细胞的损伤[9]。因此，本研究通过LPS诱导建立脓毒症血管内皮细胞模型，探讨SNHG3 通过调控miR-410-3p 对脓毒症血管内皮细胞增殖、凋亡的影响及其作用机制，旨在为脓毒症的研究提供新的潜在标志物。

1 材料与方法

1.1 样本收集 收集2018 年7 月至2019 年2 月青岛市城阳区人民医院收治的25例脓毒症患者（研究组）以及同期在本院行体格检查的25例健康志愿者（对照组）的血清，其中对照组排除血液系统疾病、严重肝、肾功能障碍等。研究组中男15 例，女10例，年龄18～65 岁；对照组中男12 例，女13 例，年龄23～57岁。本研究已取得本院伦理委员会批准。所有参与者均已签署知情同意书。

1.2 细胞和主要试剂 人脐带静脉内皮细胞（HUVECs）购自美国ATCC 公司。LPS、MTT 试剂盒购自美国Sigma公司；10%胎牛血清、DMEM培养基购自Gibco 公司；Lipofectamine 2000 试剂盒、Trizol 试剂盒购自美国Invitrogen 公司；si-NC、si-SNHG3、miR-NC、miR-410-3p、anti-miR-NC 和anti-miR-410-3p 购自广州锐博公司；引物购自上海吉玛公司；反转录试剂盒、荧光定量试剂盒购自大连宝丰公司；凋亡试剂盒购自碧云天公司；CyclinD1抗体、Bax抗体、GAPDH抗体购自美国Cell Signaling Technology公司；IgG抗体购自北京百奥莱博公司；双荧光素酶报告系统试剂盒购自南京凯基生物公司。

1.3 细胞培养和处理 HUVECs用含有10%胎牛血清的DMEM培养基，并置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养。取对数生长期的HUVECs 接种于6 孔板，每孔3×104个，用10 μg/mL 的LPS 处理细胞后，将si-NC、si-SNHG3、miR-NC、miR-410-3p、antimiR-NC 和anti-miR-410-3p 转染至HUVECs 细胞。转染时参照Lipofectamine 2000 说明书进行，转染48 h后收集细胞。正常培养且未转染的细胞作为对照（Con组）。

1.4 qRT-PCR 法检测SNHG3 和miR-410-3p 的表达 取血清及HUVECs细胞，Trizol法提取总RNA，检测其浓度和纯度，反转录合成cDNA，配置反应体系，以cDNA 为模板，在ABI 7500 型PCR 仪（Applied Biosystems公司）上进行PCR扩增。PCR反应条件：95 ℃预变性6 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，共40 个循环。SNHG3 和miR-410-3p分别以GAPDH和U6为内参，采用2-ΔΔCt法计算SNHG3和miR-410-3p相对表达量。引物序列如下：SNHG3 上游：5’-GACTTCCGGGCACTTCGTAA-3’，下游：5’-TGCTCCAAGTCTGCCAAAGA-3’；miR-410-3p 上游：5’-CCGCCA ATATAACACAGATGGCC-3’，下游：5’-GGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGC-3’。

1.5 MTT 法检测细胞增殖 收集HUVECs，以1×104个/孔细胞密度接种于96 孔板，培养48 h 后弃去各组细胞培养基，每孔内加入20 μL MTT 溶液，4 h后加入150 μL DMSO试剂，遮光反应5 min，用酶标仪检测各孔490 nm波长处的吸光度（OD）值。

1.6 流式细胞术检测细胞凋亡率 收集HUVECs细胞，以4×105个/孔细胞密度接种于6 孔板，加入500 μL 结合缓冲液，重悬细胞，参照凋亡试剂盒说明书，分别加入5µL Annexin V-FITC 及10µL PI 试剂，避光反应15 min 后置于流式细胞仪，计算细胞凋亡率。

1.7 Western blotting 法检测CyclinD1、Bax 蛋白表达 收集HUVECs 细胞，裂解后提取细胞总蛋白，取20 μg 蛋白上样，SDS-PAGE 电泳分离蛋白，将蛋白转移至PVDF膜；5%脱脂牛奶封闭2 h后，加入一抗（CyclinD1、Bax 均为1:500）4 ℃孵育过夜；洗膜，加入HRP 标记的山羊抗兔IgG 抗体（1:2 000）室温孵育2 h；ECL显影、曝光，Lane 1D软件分析蛋白条带灰度值，以目的蛋白条带灰度值与内参GAPDH蛋白条带灰度值的比值为目的蛋白表达量。

1.8 双荧光素酶实验验证SNHG3和miR-410-3p的靶向关系 Starbase 预测SNHG3 和miR-410-3p 互补结合序列，构建SNHG3 野生型载体（SNHG3-wt）和突变型载体（SNHG3-mut），并与miR-NC 或miR-410-3p共转染至HUVECs细胞，收集转染24 h的细胞，按照双荧光素酶报告检测试剂盒说明书，检测荧光素酶活性。

1.9 统计学方法 用SPSS 23.0 统计软件分析数据，计量资料以均数±标准差（）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 SNHG3 和miR-410-3p 在脓毒证患者血清及LPS 诱导的HUVECs 中的表达 与对照组比较，研究组血清SNHG3 表达显著升高，miR-410-3p 表达显著降低（均P＜0.05），见表1；与Con 组比较，LPS组SNHG3 表达显著升高，miR-410-3p 表达显著降低（均P＜0.05），见表2。

表1 SNHG3和miR-410-3p在脓毒证患者血清中的表达，n=25

表1 SNHG3和miR-410-3p在脓毒证患者血清中的表达，n=25

与对照组比较，*P＜0.05。

表2 SNHG3和miR-410-3p在LPS诱导的HUVECs中的表达

表2 SNHG3和miR-410-3p在LPS诱导的HUVECs中的表达

与Con组比较，*P＜0.05。

2.2 沉默SNHG3对LPS诱导的HUVECs增殖和凋亡的影响 与Con 组比较，LPS 组SNHG3 表达、细胞凋亡率和Bax 蛋白表达显著升高，细胞活力和CyclinD1 蛋白表达显著降低（均P＜0.05）；与LPS+si-NC组比较，LPS+si-SNHG3组SNHG3表达、细胞凋亡率和Bax蛋白表达显著降低，细胞活力和CyclinD1蛋白表达显著升高（均P＜0.05），见图1、表3。

图1 沉默SNHG3对LPS诱导的HUVECs增殖和凋亡的影响

表3 沉默SNHG3对LPS诱导的HUVECs增殖和凋亡的影响

表3 沉默SNHG3对LPS诱导的HUVECs增殖和凋亡的影响

与Con组比较，*P＜0.05；与LPS+si-NC组比较，#P＜0.05。

2.3 SNHG3调控miR-410-3p的表达 通过在线生物信息网预测了SNHG3和miR-410-3p存在互补的核苷酸序列，见图2。与miR-NC 组比较，miR-410-3p组SNHG3-wt荧光素酶活性显著降低（P＜0.05），而SNHG3-mut荧光素酶活性没有显著变化，见表4。

表4 双荧光素酶报告实验验证SNHG3与miR-410-3p的靶向关系

表4 双荧光素酶报告实验验证SNHG3与miR-410-3p的靶向关系

与miR-NC组比较，*P＜0.05。

2.4 过表达miR-410-3p 对LPS 诱导的HUVECs 增殖和凋亡的影响 与Con 组比较，LPS 组miR-410-3p 表达、细胞活力和CyclinD1 蛋白表达显著降低，细胞凋亡率和Bax蛋白表达显著升高（均P＜0.05）；与LPS+miR-NC 组比较，LPS+miR-410-3p 组miR-410-3p表达、细胞活力和CyclinD1蛋白表达显著升高，细胞凋亡率和Bax 蛋白表达显著降低（均P＜0.05），见图3、表5。

表5 过表达miR-410-3p对LPS诱导的HUVECs增殖和凋亡的影响

表5 过表达miR-410-3p对LPS诱导的HUVECs增殖和凋亡的影响

与Con组比较，*P＜0.05；与LPS+miR-NC组比较，#P＜0.05。

图3 过表达miR-410-3p对LPS诱导的HUVECs增殖和凋亡的影响

2.5 抑制miR-410-3p可以逆转沉默SNHG3对LPS诱导的HUVECs增殖和凋亡的影响 与LPS+si-NC组比较，LPS+si-SNHG3组miR-410-3p表达、细胞活力和CyclinD1 蛋白表达显著升高，细胞凋亡率和Bax蛋白表达显著降低（均P＜0.05）；与LPS+si-SNHG3+anti-miR-NC 组比较，LPS+si-SNHG3+antimiR-410-3p 组miR-410-3p 表达、细胞活力和CyclinD1 蛋白表达显著降低，细胞凋亡率和Bax 蛋白表达显著升高（均P＜0.05），见图4、表6。

表6 抑制miR-410-3p可以逆转沉默SNHG3对LPS诱导的HUVECs增殖和凋亡的影响

表6 抑制miR-410-3p可以逆转沉默SNHG3对LPS诱导的HUVECs增殖和凋亡的影响

与LPS+si-NC组比较，*P＜0.05；与LPS+si-SNHG3+anti-miR-NC组比较，#P＜0.05。

图4 抑制miR-410-3p可以逆转沉默SNHG3对LPS诱导的HUVECs增殖和凋亡的影响

3 讨论

休克、急性肺损伤、心肌损伤均为脓毒症常见的并发症，也是脓毒症病死率较高的主要原因[10]。近年来越来越多的研究表明，lncRNA 在脓毒症的发生、发展中具有重要作用。张思敏等[11]研究显示，过表达FEZF1-AS1 或抑制miR-363-3p 可明显抑制LPS 诱导HUVECs 增殖并促进凋亡，提示lncRNA FEZF1-AS1 靶向调控miR-363-3p 的表达抑制脓毒症的发生。Zhang 等[12]研究发现，NEAT1 在脓毒症患者肝组织和LPS 诱导的Raw264.7 细胞中表达上调，其通过调控Let-7a/TLR4 轴减轻LPS 诱导的肝损伤。Wu等[13]发现，沉默HOTAIR可以保护LPS诱导的脓毒症小鼠的心脏功能。此外，有学者通过微阵列筛查差异表达lncRNA，发现MEG3在脓毒症患者的血清中表达上调，与较高的死亡率和不良预后有关；沉默MEG3 可以抑制LPS 诱导的肾上皮细胞和心肌细胞凋亡[14]。Shan等[15]通过LPS刺激心肌细胞建立脓毒症心肌细胞模型，结果显示，H19在LPS诱导的心肌细胞中表达下调，过表达H19可明显抑制LPS 诱导的心肌细胞凋亡和炎症反应；H19 通过调节miR-93-5p/SORBS2轴抑制脓毒症诱发的心肌细胞损伤。SNHG3在多种癌症中表达上调，与肿瘤的大小、晚期TNM分期、淋巴结转移和不良的预后显著相关，参与细胞的增殖、凋亡和转移等过程[16-17]。SNHG3 在肝癌组织中表达上调，敲低SNHG3可以明显抑制肝癌细胞的增殖、迁移和上皮间质转化，并促进癌细胞凋亡，SNHG3 调控miR-326促进肝癌细胞发展[18]。本研究中，SNHG3在脓毒症患者血清和LPS诱导HUVECs细胞中的表达上调，沉默SNHG3 明显抑制LPS 诱导HUVECs 增殖，诱导细胞凋亡，说明SNHG3 可以作为脓毒症的潜在生物标志物。

miRNA 是非编码RNA 的一员，没有编码蛋白的功能，可抑制或促进mRNA的翻译及转录调控基因的表达，进而参与脓毒症的发展[19]。黄钟等[20]建立脓毒症大鼠模型，结果显示miR-128-3p 表达上调，沉默miR-128-3p 可明显减缓大鼠急性肺损伤，抑制大鼠肺细胞凋亡和炎症反应。Yuan等[21]发现，过表达miR-30a可抑制脓毒症大鼠肝细胞增殖并诱导细胞凋亡；miR-30a 负调控SOCS-1 激活JAK/STAT 信号通路调控脓毒症诱发的肝损伤。miR-126a-3p 在LPS 诱导的小鼠血管内皮细胞中表达下调，过表达miR-126a-3p 可以抑制血管内皮细胞的增殖和迁移，并诱导细胞凋亡[22]。

SNHG3 可调控下游多个miRNA 的表达，通过在线数据库显示，SNHG3 与miR-410-3p 存在互补结合位点。miR-410-3p 在多种癌症和疾病中异常表达，如miR-410-3p在类风湿关节炎患者的滑膜组织和成纤维细胞样滑膜细胞中表达下调，miR-410-3p通过下调YY1抑制类风湿关节炎细胞的增殖，阻滞细胞周期，促进细胞凋亡[23]。本研究结果显示，miR-410-3p在脓毒症患者血清和LPS诱导HUVECs中表达下调，过表达miR-410-3p可明显抑制LPS诱导HUVECs细胞增殖，诱导细胞凋亡。进一步实验结果显示，SNHG3 可靶向调控miR-410-3p 的表达，抑制miR-410-3p逆转了沉默SNHG3对LPS诱导的HUVECs 增殖和凋亡的作用。提示沉默SNHG3 可能通过上调miR-410-3p 表达抑制脓毒症的发展，SNHG3/miR-410-3p 可作为脓毒症的诊断和治疗的新靶点。