喉癌组织中MMP-2和VEGF的表达与转移相关性的研究*

杨 雪，冯志星，彭丽娜，马海滨，单 珊，韩海平

（河北省邯郸市中心医院，邯郸 056001）

喉癌是一种耳鼻喉颈科常见的恶性肿瘤之一，其中喉鳞状细胞癌是最为常见，发病率约占全身恶性肿瘤1.5%，是发病率最高的恶性肿瘤之一。喉癌有声音嘶哑、发生困难和呼吸困难等临床表现[1-2]，还具有易复发和易转移等特点，同时对于放化疗不敏感，手术治疗是目前针对喉癌的主要手段，但预后效果还是不尽人意，5年生存率仅为63%[3]。有研究表明，淋巴结转移是影响喉癌患者预后的主要因素之一[4-5]。MMP-2 是具有分解细胞外基质能力的非糖化的明胶酶，与肺癌、胃癌等多种恶性肿瘤的侵袭和转移有关[6-7]。同时，缺氧也是促进血管内皮生长因子(VEGF）合成的最为重要的因素，有研究表明，在缺氧条件下细胞内的VEGF 存在过表达数倍的现象[8]。肿瘤血管形成在肿瘤发生发展中扮演着不可或缺的角色，VEGF及其受体参与了肝细胞癌、结肠癌等多种肿瘤的血管的生成[9～10]。本研究通过检测喉癌组织中MMP-2 和VEGF 的表达，分析MMP-2 和VEGF的表达对癌症转移的影响，现将结果报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集我院2013 年8 月至2018 年11 月经手术治疗并经过病理证实的53 例喉癌患者的包埋石蜡标本（喉癌组）及其癌旁组织（癌旁组)，其中男42 例，女11例，年龄37～73岁，平均（55.49±7.50）岁。研究对象均为喉鳞状细胞癌，病理分型：高分化37例，中分化11 例，低分化5 例；原发部位：声门型33 例，声门下型13例，声门上型7例；TMN分期：Ⅰ期10例，Ⅱ期18例，Ⅲ期16例，Ⅳ期9例；其中有淋巴结转移14 例，无淋巴结转移39 例。所选标本均在术后2 h内处理。

1.2 主要试剂

MMP-2 兔抗人多克隆抗体、VEGF 兔抗人多克隆抗体均由Cell Signaling Technology 公司提供。SP9000 试剂盒由中杉金桥公司提供，DAB 显色试剂均由博士德生物公司提供。

1.3 方法

1.3.1 免疫组化检测MMP-2和VEGF表达情况

将石蜡标本切片后用二甲苯脱蜡、梯度乙醇（100%、100%、95%、95%和85%各3 min）、PBS冲洗后，经枸椽酸缓冲液高压修复2 min，PBS冲洗，浸泡在含3%的H2O2的去离子水中10 min，PBS 冲洗，加山羊血清工作液封闭15 min后去血清，加入对应一抗（MMP-2 和VEGF 抗体，工作浓度均为1∶50）于4 ℃冰箱孵育过夜，用PBS 冲洗后加即用型生物素标记的二抗，室温孵育15 min，滴加辣根酶标记的链霉卵血清工作液15 min，经PBS 冲洗后加新配置的DAB溶液显色，水洗、苏木精复染、脱水、封片，最后用显微图像分析系统分析处理，MMP-2和VEGF均用积分光密度值(Integrated Optical Density，IOD)表示。以PBS替代一抗作为染色的阴性对照。

1.3.2 MMP-2和VEGF的表达对喉癌相关性分析

采用Spearman 分析喉癌组织中MMP-2 和VEGF的表达与喉癌淋巴结转移的相关性。

1.4 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行数据分析，符合正态分布的计量资料用均数±标准差()表示，两间比较采用t检验，多组均值比较采用单因素方差分析，两两比较行LSD-t检验；MMP-2 和VEGF 的表达与喉癌淋巴结转移的相关分析采用Spearman 分析。以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 喉癌组织和癌旁组织MMP-2和VEGF的表达情况

免疫组化染色结果显示，MMP-2在喉癌组织中主要弥漫性分布在胞浆中，在癌旁组织中呈弱表达；VEGF在喉癌组织中在血管周围染色明显，在癌旁组织中呈弱表达，见图1、图2。喉癌组织中MMP-2 和VEGF 的表达均明显高于癌旁组织（t=10.563、7.815，P＜0.05），见表1。

表1 喉癌组织和癌旁组织MMP-2和VEGF的表达比较

表1 喉癌组织和癌旁组织MMP-2和VEGF的表达比较

图1 喉癌组织MMP-2和VEGF的表达情况（×400）

图2 癌旁组织MMP-2和VEGF的表达情况（×100）

2.2 MMP-2 和VEGF 的表达对喉癌临床病理特征的影响

53例患者中，喉癌组织MMP-2和VEGF的表达在性别、年龄和原发部位中差异无统计学意义（P＞0.05）；在病理分型、TMN分期和淋巴结转移中差异具有统计学意义（均P＜0.05）；与无淋巴结转移组相比较，有淋巴结转移组的MMP-2和VEGF的表达均升高（P＜0.05），见表2。

表2 MMP-2和VEGF的表达对喉癌临床病理特征的影响

表2 MMP-2和VEGF的表达对喉癌临床病理特征的影响

与高分化组比较，*P＜0.05；与中分化组比较，#P＜0.05；；与Ⅰ期相比较，△P＜0.05，与Ⅱ期相比较，▲P＜0.05，与Ⅲ期相比较，○P＜0.05。

2.3 MMP-2 和VEGF 表达水平与喉癌淋巴结转移相关性分析

Spearman 相关性分析结果显示，MMP-2 和VEG 水平与淋巴结转移呈负相关关系（r=-0.736、-0.588，均P＜0.05）。

3 讨论

有研究认为，吸烟、饮酒、职业因素、空气污染、性激素及病毒感染均与喉癌发生密切相关[4]。喉癌尽管是头颈部常见肿瘤之一，尽管近年来医疗手段有了明显的进步，但喉癌患者手术生存率仍有下降趋势[11]。影响其预后的主要因素之一就是肿瘤转移，由于喉癌早期症状不明显，部分患者就医时已出现淋巴结转移，采用手术治疗还需要行淋巴结清除术，同时术后伴有并发症[12]。

MMP-2 由12 个内含子以及13 个外显子组成，基因长度为27 kb，多项研究显示，MMP-2能降解细胞外基质的主要成分，细胞外基质能起到稳定细胞的作用，是肿瘤细胞侵袭和转移过程中的一道屏障，当细胞外基质受到降解和破坏时，肿瘤细胞更容易穿透组织细胞的基底膜和血管，转移到其他的组织部位，因此MMP-2 表达能力越强，肿瘤细胞越不稳定，发生侵袭、转移的概率越大[13-14]。VEGF 广泛存在于机体中，是血管生成不可或缺的因素，而新生血管是肿瘤发展必要条件。已有研究表明，VEGF参与了肿瘤的发生发展，对于肿瘤的增殖、迁移、侵袭有着重要的意义[15]。在本研究中，与癌旁组织相比，喉癌组织的MMP-2 和VEGF 的表达均升高，表明喉癌组织中MMP-2 和VEGF 均存在过表达，与此前研究结果相似，提示在喉癌组织中可能存在应激反应使得MMP-2及VEGF表达上调，并参与了喉癌的发生发展过程。本研究结果还显示，喉癌组织MMP-2和VEGF的表达在性别、年龄和原发部位中无明显差异，而在病理分型、TMN 分期和淋巴结转移中差异具有统计学意义。与无淋巴结转移组相比较，有淋巴结转移组的MMP-2和VEGF的表达均升高。提示喉癌组织中MMP-2 和VEGF 的表达与喉癌的病理分型、TMN分期及淋巴结转移均有密切相关。同时，Spearman 相关性分析结果提示，MMP-2 和VEG 水平均与淋巴结转移呈负相关关系。

综上所述，MMP-2与VEGF在喉癌组织中存在过表达，且与淋巴结转移负相关。本研究在一定程度上为喉癌的早期诊断和临床治疗提供了理论参考。此外，本研究存在一些不足，如受试者均为本院所接收，因此研究在样本选取中存在局限性，同时样本数量不足，结果存在一定的局限性，后续应扩大样本数据展开研究。