山姜素对食管癌EC9706细胞的凋亡和自噬及其PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响*

唐 凤，杨春华，张万涛，覃鸿恩，周 辉

（恩施土家族苗族自治州中心医院 1.中药房，2.西药房，3.制剂室，恩施 445000；4.湖北民族大学附属民大医院西药房,恩施 445000）

食管癌是目前世界上最普遍的癌症之一，在癌症相关死亡率中排名第6 位[1]。据世界卫生组织统计，大约一半的食管癌病例发生在中国，主要组织类型为鳞状细胞癌，患者整体5 年生存率低于20%[2]。食管癌早期的临床症状不显著，通常在晚期才被诊断出来。食管癌患者预后较差与晚期诊断和癌症转移的趋势有关[3]。目前，同步放化疗仍然是晚期食管癌的主要治疗方法。但食管癌对现有化疗药物的敏感性较差，治疗效果有限，且存在较大的副作用[4]。因此，开发用于治疗食管癌的有效药物具有重大意义。山姜素是从姜科植物草豆蔻种子中分离得到的一种天然类黄酮，具有多种生物作用，如抗炎、抗氧化和降血脂活性[5-6]。此外，山姜素也显示出抵抗癌症的巨大潜力，对卵巢癌[7]、口腔鳞状细胞癌[8]等多种癌症细胞具有抑制作用。但其在食管癌中的作用及机制尚不明确。因此，本研究通过观察山姜素对食管癌EC9706 细胞的影响，并探讨其作用机制，为开发食管癌的有效治疗药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

人食管癌EC9706 细胞株购买自上海酶研生物科技有限公司（货号：CC-Y1571）；山姜素购买自上海纯优生物科技有限公司（货号：P0133）；RPMI 1640 细胞培养基（货号：31800022）、胰蛋白酶（货号：25200056）购买自美国Gibco 公司；胎牛血清（货号：04-001-1ACS）购买自以色列BI 公司；Annexin V-FITC/PI 细胞凋亡检测试剂盒（货号：40302ES50）、BCA蛋白浓度测定试剂盒（货号：20201ES76）、DAPI 染料（货号：40728ES03）购买自上海翊圣生物科技有限公司；MTT 检测试剂盒（货号：ZY2050-500T）购买自上海泽叶生物技术公司；兔抗人Ki67（货号：26809-1-AP）、PCNA（货号：10205-2-AP）、Caspase-3（货号：19677-1-AP）、Caspase-9（货号：10380-1-AP）、Beclin1（货号：11306-1-AP）、ATG8（货号：11010-1-AP）、p62（货号：18420-1-AP）、LC3（货号：14600-1-AP）、PI3K（货号：67071-1-Ig）、p-PI3K（货号：60225-1-Ig）、Akt（货号：60203-2-Ig）、p-Akt（货号：66444-1-Ig）、mTOR（货号：66888-1-Ig）、pmTOR（货号：67778-1-Ig）、GAPDH（货号：66009-1-Ig）单抗，辣根过氧化酶（HRP）标记羊抗兔IgG二抗（货号：10285-1-AP）、山羊抗兔Alexa Fluor488 二抗（货号：srbAF488-1）购买自美国Proteintech Group公司；

1.2 方法

常规复苏食管癌EC9706 细胞，加入适量添加有10%胎牛血清的RPMI 1640 完全培养基重悬细胞，于37 ℃、5%CO2浓度条件下在细胞培养箱中恒温培养备用。

1.2.2 MTT法检测细胞活性

取对数期生长管癌EC9706细胞，以5×103个细胞每孔接种100 μL于96孔板，培养24 h后更换培养基为山姜素终浓度（0 μmol/L、6.25 μmol/L、12.5 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L、800 μmol/L）的RPMI 1640 培养基100 μL，药物剂量参照相关文献[9]；分别培养0 h、24 h、48 h、72 h后取出培养细胞，加入20 μL MTT溶液培养；4 h后取出培养基加入150 μL DMSO溶液，摇床震荡10 min，置于酶标仪（美国Molecular Devices，SpectraMax iD）在490nm 波长下测量各孔吸光度值，以0 μmol/L 山姜素组作为对照组，计算细胞活性。细胞活性=各组吸光度值/对照组吸光度值×100%。每组实验重复3次。

1.2.3 细胞克隆实验

取对数生长期生长食管癌EC9706细胞，以500个细胞每孔接种于6孔板中，贴壁后，分别加入含终浓度为0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L山姜素的RPMI 1640 培养基2mL，隔天更换含同浓度山姜素的新鲜培养基，培养至肉眼可见克隆形成时停止培养；弃上清液，PBS 小心清洗2 次，加入甲醇固定15 min，弃去固定液，加入Giemsa 染液染色30 min，拍照计数克隆数目，0 μmol/L山姜素组作为对照组。克隆形成率=克隆数目/接种细胞数×100%。每组实验重复3次。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡

取对数期生长食管癌EC9706 细胞，计数后以106个细胞每孔接种于96 孔板，更换培养基为山姜素终浓度（0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L）的RPMI 1640 细胞培养基。48 h 后离心收集细胞，PBS 洗涤，弃清液，依次加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC 溶液和10 μL PI 溶液染色30 min，使用流式细胞仪（美国贝克曼，DxFLEX）检测凋亡数，0 μmol/L山姜素组作为对照组，计算凋亡率。凋亡率=凋亡细胞数/总细胞数×100%。每组实验重复3次。

1.2.5 免疫荧光染色检测LC3在细胞中的表达量

新杨塔村的重大事项，涉及村民切身利益的事项，先由村支委提议，然后两委会商议，监委会列席，交党员大会审议后，再上村民代表大会决议。

将食管癌EC9706 细胞接种到含有细胞爬片的6 孔板中，更换培养基为山姜素终浓度（0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L）的RPMI 1640 细胞培养基。培养48 h 后，取出爬片，PBS 清洗3 次，加入4%多聚甲醛固定30 min；PBS 清洗3 次，加入0.2%Triton X-100 通透液处理15 min；PBS清洗3次，加入5%与一抗（1∶100 比例稀释）同源血清封闭1 h；PBS清洗3次，加入稀释好的LC3抗体，置于湿盒中4 ℃孵育过夜；PBS 清洗3 次，加入山羊抗兔Alexa Fluor488 二抗（1∶100 比例稀释），室温孵育2 h；PBS 清洗3 次，加入DAPI 染色10 min；洗涤，封片，置于荧光显微镜下观察。随机取400 倍显微镜视野5个，计数LC3阳性表达细胞，计算LC3阳性表达率。每组实验重复3次。

1.2.6 Western blotting 法检测蛋白表达水平

取对数生长期且生长食管癌EC9706 细胞，计数后以106个细胞每孔接种于96 孔板，更换培养基为山姜素终浓度（0 μmol/L、25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L）的RPMI 1640 细胞培养基。培养48 h后，使用PBS冲洗细胞，加入0.25%胰蛋白酶进行消化处理3～5 min，用完全培养基终止消化反应，重悬细胞后用PBS清洗2次，离心弃上清。加入50 μL细胞裂解液，离心收集上清液。按照BCA法使用试剂盒测定蛋白质浓度，根据测量浓度加入相应体积的待测样品于SDS-PAGE 凝胶中，转印到PVDF 膜上。将PVDF 膜浸入封闭液中2 h，用TBST 清洗膜3次，每次3 min。依据试剂盒说明书加入相应浓度GAPDH、Ki67、PCNA、Caspase-3、Caspase-9、Beclin1、ATG8、p62、LC3 Ⅱ、LC3 Ⅰ、PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR蛋白一抗（1∶1 000比例稀释），4 ℃孵育过夜，TBST清洗膜3次；加入对应浓度二抗（1∶5 000 比例稀释），室温孵育2 h，TBST 清洗膜3次；避光加入ECL发光染色，使用凝胶成像仪进行成像分析。采用TotalLab 2.0 进行灰度分析，以GAPDH 作为内参，计算蛋白的相对表达量。每组实验重复3次。

1.3 统计学方法

采用SPSS 20.0 统计学软件对数据进行统计处理。多组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用LSD-t法。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 山姜素对食管癌EC9706细胞活性的影响

随着山姜素浓度的增加，食管癌EC9706 细胞活性明显下降；随着培养时间增加，食管癌EC9706细胞活性逐渐下降。在培养48 h后，山姜素浓度为25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L时，食管癌EC9706细胞活性＞70%。因此，本研究选择药物浓度25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L，作用时间48 h进行后续实验。

2.2 山姜素对食管癌EC9706细胞增殖的影响

随着山姜素浓度的增加，食管癌EC9706 细胞克隆形成数目逐渐下降；山姜素浓度为50 μmol/L、100 μmol/L 时，食管癌EC9706 细胞克隆形成率显著低于对照组（P＜0.05），见图1A。随着山姜素浓度的增加，食管癌EC9706 细胞Ki67、PCNA 蛋白表达水平逐渐下降；山姜素浓度为50 μmol/L、100 μmol/L 时，食管癌EC9706 细胞Ki67、PCNA 蛋白表达水平显著低于对照组（均P＜0.05），见图1B。

图1 山姜素对食管癌EC9706细胞增殖的影响

2.3 山姜素对食管癌EC9706细胞凋亡的影响

培养48 h 后，随着山姜素浓度的增加，食管癌EC9706 细胞凋亡数逐渐增加；山姜素浓度为50 μmol/L、100 μmol/L时，食管癌EC9706细胞凋亡率显著高于对照组（均P＜0.05），见图2A。随着山姜素浓度的增加，食管癌EC9706细胞cleaved cas-3、cleaved cas-9 蛋白表达水平逐渐上升；山姜素浓度为50 μmol/L、100 μmol/L 时，食管癌EC9706 细胞cleaved cas-3/cas-3、cleaved cas-9/cas-9 蛋白表达水平显著高于对照组（均P＜0.05），见图2B。

图2 山姜素对食管癌EC9706细胞凋亡的影响

2.4 山姜素对食管癌EC9706细胞自噬的影响

随着山姜素浓度的增加，食管癌EC9706 细胞Beclin1、ATG8、LC3Ⅱ蛋白表达水平逐渐上升，p62蛋白表达水平逐渐下降；山姜素浓度为50 μmol/L、100 μmol/L时，食管癌EC9706细胞Beclin1、ATG8、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平显著高于对照组，p62 水平显著低于对照组（P＜0.05），见图3A。随着山姜素浓度的增加，食管癌EC9706细胞LC3阳性数逐渐升高；山姜素浓度为50 μmol/L、100 μmol/L 时，食管癌EC9706 细胞LC3 阳性率显著高于对照组（均P＜0.05），见图3B。

2.5 山姜素对食管癌EC9706 细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

随着山姜素浓度的增加，食管癌EC9706 细胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR 蛋白表达水平逐渐降低；山姜素浓度为50 μmol/L、100 μmol/L 时，食管癌EC9706 细 胞p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR显著低于对照组（均P＜0.05），见图4。

图4 山姜素对食管癌EC9706细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路的影响

3 讨论

由于食管癌缺乏特定的早期症状、明显的发病体征和早期诊断标志物，约35%的患者就诊时已进入晚期，预后不良[9]。因此，寻找新的有效治疗药物，对延长食管癌患者的生存期具有重要意义。山姜素可抑制不同癌细胞株的增殖并诱导凋亡，发挥抗癌活性。然而，山姜素对食管癌的作用仍知之甚少。本研究MMT 检测结果显示，随着山姜素浓度和作用时间的增加，食管癌EC9706 细胞活性明显下降，提示山姜素对食管癌具有抗肿瘤作用。排除山姜素细胞毒性对实验结果的影响，选取培养时间为48 h，山姜素浓度为25 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L进行后续实验。

恶性肿瘤较强的促增殖能力和抗凋亡能力是其发生发展的关键。本研究通过细胞克隆实验检测细胞增殖能力，结果显示，随着山姜素剂量的增加，食管癌EC9706 细胞克隆形成数目逐渐减少。Ki67是一种核增殖相关抗原，存在于活跃增殖的细胞中，在细胞周期的生长和合成阶段表达，可指示细胞增殖的程度[10]。PCNA 是细胞增殖的标志物，在大多数类型的实体恶性肿瘤中，例如结直肠癌和乳腺癌，PCNA与预后和生存密切相关[11-12]。本研究中，随着山姜素剂量的增加，食管癌EC9706 细胞Ki67、PCNA蛋白表达水平逐渐下降。此外，流式细胞仪分析结果显示，随着山姜素浓度的增加，食管癌EC9706细胞凋亡数逐渐增加。Caspase是一种天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶，在凋亡过程中起着至关重要的作用，活化的Caspase-9可以有效切割并激活下游的Caspase-3诱导细胞凋亡[13-14]。本研究结果显示，随着山姜素剂量的增加，食管癌EC9706细胞cleaved cas-3、cleaved cas-9蛋白表达水平逐渐上升。这些结果表明，山姜素具有抑制食管癌细胞增殖和促进食管癌细胞凋亡的能力，并且作用效果随剂量增加而加强，与前人的研究结果相似[15]。

自噬是真核细胞最重要的细胞内降解系统之一，在不利的环境条件激活，自噬可选择性地降解一些多余的成分，以满足紧急情况下人体对能量的需求。近年来证据表明，自噬在肿瘤的发生和发展中起着重要作用[16]。Beclin1 是参与自噬小体成核早期的关键蛋白，可与其他自噬相关蛋白相互作用，随后募集ATG 蛋白，参与编排自噬小体和自溶酶体的形成[17]。此外，LC3 蛋白已被用作自噬的指标，其存在于自噬小体的膜上，发生自噬时，LC3Ⅰ会向LC3Ⅱ转化，因此，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ通常与自噬小体的形成程度密切相关[18]。p62 是自噬通量的重要指标，它通过直接与自噬膜上的LC3 结合，选择性地并入自噬体，随后在自溶酶体中降解[19]。在本研究中，随着山姜素浓度的增加，食管癌EC9706细胞Beclin1、ATG8、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ水平逐渐上升，p62 蛋白表达水平逐渐下降，LC3 阳性率逐渐升高。表明山姜素能诱导食管癌EC9706 细胞自噬，并呈剂量依赖性。

广泛分布于细胞内的PI3K/AKT/mTOR信号通路已被证明参与细胞生长、增殖、凋亡和分化调控等多种代谢过程的重要信号通路[20]。这种信号的异常激活已在包括食管癌在内的人类癌症中广泛报道[21]。有报道称，一些抗癌药物可以通过阻断PI3K/Akt/mTOR 通路抑制肿瘤细胞增殖[22]。此外，通过抑制PI3K/Akt/mTOR 信号通路可诱导细胞凋亡和自噬[23]。PI3K/Akt/mTOR 信号通路通过介导pmTOR 水平负向调控自噬，而p-Akt 是凋亡过程中的一个重要事件。在本研究中，随着山姜素浓度的增加，食管癌EC9706 细胞p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达水平逐渐降低。提示山姜素能抑制食管癌EC9706细胞PI3K/AKT/mTOR信号通路激活，并可能与其诱导食管癌EC9706 细胞凋亡和自噬有关。

综上所述，山姜素能抑制食管癌EC9706 细胞增殖，促进食管癌EC9706细胞凋亡和自噬，这可能与其能抑制PI3K/AKT/mTOR 信号通路有关，表明山姜素存在用于食管癌治疗的潜在价值。