纳豆芽胞杆菌固定化载体改性及吸附研究

陈龙军 林程 林陈强 张慧 贾宪波 方宇 陈济琛

摘要：【目的】以麥饭石为载体，制备高效的纳豆芽胞杆菌同体菌剂，为纳豆芽胞杆菌的规模化应用奠定基础。【方法】运用酸、碱、盐等方法探索麦饭石进行改性条件，扩大麦饭石孔隙度及比表面积，提升其吸附能力;并通过添加保护剂（葡萄糖、糊精、淀粉）增加保藏期固体菌剂的有效活菌数残留率，为长期保藏固体粉剂提供技术支持。【结果】 （1）确定了纳豆芽胞杆菌最适培养温度为40℃，最适培养pH为7.5。（2）经氯化钠、盐酸、硫酸和氢氧化钠溶液改性后的麦饭石吸附最大有效活菌数分别为13.17. 12.6、12.7和11.9（×108 CFU-g-1）。其中0 5mol L-1氯化钠溶液改性效果最好，吸附有效活菌数达到13.17（×108 CFU·g-1）。（3）对照组、添加保护剂组（2%糊精、2%葡萄糖、2%淀粉）保藏至6个月时，有效活菌数分别为2.91. 4.1、5.42和4.63（×108 CFU·g-1）。活菌数残留率为初始活菌数的22%、31%、41%和35%，其中2%葡萄糖保护剂比对照组有效活菌数残留率提高了1.86倍。【结论】改性麦饭石能极大提升麦饭石的吸附能力，同时保护剂的添加有利于麦饭石固体芽胞杆菌粉剂的长期保藏，本研究为麦饭石在微生物菌剂制备工艺的应用提供了一定的技术支持。

关键词：纳豆芽胞杆;麦饭石;改性;保护剂;吸附

中图分类号：Q 939.96

文献标志码：A

文章编号：1008-0384（ 2021） 07-0855-06

Functional Improvements on Immobilization Carrier of

Bacillus Culture for Natto Fermentation

CHEN Longjun1， LIN Cheng2. LIN Chenqiang1， ZHANG Hui1. JIA Xianbo1. FANG Yu1. CHEN Jichen1*

（ I. Soil and Fertilizer Institute， Fujian Acaderiy of Agricultural Sciences. Fuzhou. Fujian

350003. China;

2. Fuzhou Agricultural and Rural Bureau， Fuzhou， Fujian

350003. China ）Abstract： 【Objective】The physical properties of maifanshi. a volcanic rock. were modified to improve its porosity andadsorption to be used as an immobilization carrier for natto fermentation bacteria that was further added with protective agentsto extend the shelf life of viable Bacillus natto. 【Method】 Maifanshi was treated by acid. alkali. or salt to modify the porosityand surface adsorption property as a microbial carrier. Various protective agents， such as glucose. dextrin. and/or starch wereincorporated to help prolong the viability of the imbedded B. natto powder. 【Result】 （1） The optimum conditions for B. nattoculture included 40℃ and pH 7.5. （2） The maximum viable bacteria count was the highest at 13.17X 108 CFU·g-I on themaifanshi carriers modified by 0.5 mol·L-1sodium chloride solution. It was followed by a count of 12.7 X 108 CFU·g-1 0nmaifanshi treated by sulfuric acid. 12.6 X 108 CFU·g-l on maifanshi treated by hydrochloric acid. and 1 1 .9 X 108 CFU. g-l onmaifanshi treated by sodium hydroxide. （3） The viable B. natto counts after 6 months in storage on control was 2.91 X 108CFU·g-l as compared to those immobilized on the carriers with addition of 2% dextrin. 2% glucose， or 2% starch being4.1 X 108 CFU·g-1， 5.42X 10 8 CFU·g-1， and 4.63 X lOs CFU·g-1， respectively. The retention of viable B. natto on the NaCI-treated maifanshi with the addition of dextrin was 31%. that of glucose 41%. that of starch 35%. and that of control 22%.【Conclusion】 As a bacteria carrier. maifanshi could be significantly further improved on the adsorption capacity bymodification such as NaCI treatment. With an addition of 2% glucose on the immobilized system. the retained viable B. nattocount could rise l .86 times over control in 6 months of storage. It appeared that this study had paved the way of developing apractical application of maifanshi for natto fermentation industry.

2 结果与分析

2.1温度对纳豆芽胞杆菌生长的影响

为了研究适宜纳豆芽孢杆菌生长的最佳温度，在pH 7.0、150 r·mm_1条件下，设置温度分别为30、35、40、45，50℃进行发酵培养18 h（对数生长末期）。由图1可以看出，不同温度下，纳豆芽胞杆菌培养至对数生长末期，进入稳定期后，有效活菌数各不相同，随着培养温度升高（ 25～40℃），有效活菌数逐渐升高，当培养温度为40℃时，有效活菌数达到最大值12.88×lOb CFU·mL-l。之后随温度继续升高（ 40～50℃），有效活菌数逐渐降低，由此可见，纳豆芽胞杆菌最适培养温度为40 ℃。

2.2 pH对纳豆芽胞杆菌生长的影响

为了研究适宜枯草芽孢杆菌生长的最佳pH值，将菌液pH值分别调节为5.5、6、6.5、7、7.5、8和8.5等7个梯度，分别放入最适培养温度为40℃的震荡摇床中培养至对数生长末期（18h），测其有效活菌数。pH对纳豆芽孢杆菌生长的影响如下图2所示。随着培养pH升高（5.5～7.5），有效活菌数逐渐升高，当培养pH为7.5时，有效活菌数达到最大值13.68×lOs CFU·mL-l。之后随pH继续升高（7.5～8.5），有效活菌数逐渐降低，由此可见，纳豆芽胞杆菌最适培养pH为7.5。

2.3不同改性剂及浓度对载体吸菌效果的影响

采用不同浓度改性剂（酸、碱、盐）对麦饭石进行处理，考察改性后的麦饭石对纳豆芽胞杆菌的吸附效果，结果如图3所示。

由图3可知，在低浓度改性剂条件下（小于0.5mol·L-l），纳豆芽孢杆菌的吸附有效活菌数随着浓度升高，呈逐渐增长趋势;究其原因，由于在较低的改性浓度下，天然麥饭石原本被堵塞的孔径，在改性剂的作用下，逐渐被打通，随着改性剂溶液浓度增加，改性效果渐好，吸附有效活菌数也随之增加;当改性剂浓度高于0.5 mol·L-l时，吸附纳豆芽孢杆菌的有效活菌数随着改性剂浓度增加而逐渐减少，这可能是由于过高改性剂浓度对纳豆芽孢杆菌活性产生了抑制的缘故，因此当改性剂浓度超过一定值后，吸附的有效活菌数反而随浓度升高而降低。以未改性麦饭石为对照[（ 11.35±0.35）×10 8 CFU·g-l]，当改性剂浓度为o.5mol·L-l时，吸附纳豆芽孢杆菌有效活菌数均达到最大值，经氯化钠、盐酸、硫酸和氢氧化钠溶液改性后的麦饭石吸附最大有效活菌数分别13 .17±0.44、12.6±0.33、12.7±0.38和11.9±0.42（×108 CFU·g-l）。其中，0.5 mol·L-l氯化钠溶液改性的麦饭石，其吸附纳豆芽孢杆菌效果最好，吸附有效活菌数达到13.17±0.44（×108CFU·g-l）。

2.4改性前后吸附效果比较

由表1可以看出，未改性麦饭石吸附纳豆芽胞杆菌有效活菌数为11.35±0.35（×108 CFU·g-l），吸附率83%;而经过0.5 mol.L-l NaC1溶液改性的麦饭石有效活菌数达到了13.17±0.44（×lOs CFU·mL-l），吸附率达96.3%，相比未改性前，吸附率提高了13 .3%。究其原因，多孔性海绵结构的麦饭石经NaC1溶液改性后，空隙打开，比表面积增大，加之麦饭石较强的静电吸附力，从而进一步提高了其吸菌效率。由此可见，改性麦饭石在微生物固体菌剂制备中具有重要应用价值。

2.5载体固定化微生物

为更直观地反映麦饭石改性前后对纳豆芽孢杆菌吸附效果的影响，通过扫描电镜观察麦饭石表面结构变化，如图4所示。2 500倍扫描电镜下可以清晰的看出，与未改性麦饭石（图4-A）相比，改性后的麦饭石（图4-B）表面去除了许多细小颗粒、杂质，大量的空隙被疏通，极大提高了载体孔隙度和比表面积。改性麦饭石吸附菌液后（图4-C），观察到载体大量空隙被纳豆芽胞杆菌充满，同时表面附着大量的纳豆芽孢杆菌，结合表1载体吸附率，进一步说明改性麦饭石具有更强的吸菌能力。

2.6保护剂对固化菌剂保藏期的影响

固态菌剂保藏费用低、可以直接投入发酵，且在运输和贮藏、质量控制等方面有其独特的优势。本文考察了3种保护剂（糊精、葡萄糖、淀粉）在纳豆芽胞杆菌固体菌剂中的应用效果。结果如图5所示，未添加保护剂的对照组在整个保藏期内，菌剂有效活菌数始终低于同时期的试验组（2%糊精、2%葡萄糖、2%淀粉）。菌剂保藏第一个月，添加保护剂的试验组，有效活菌数均有不同程度提高，尤其是葡萄糖作为保护剂时，有效活菌数达到13.65×lOs CFU·g-1，而对照组略有下降;从第二个月开始，随着保藏期的延长，有效活菌数均呈下降趋势，保藏至6个月时，对照组、糊精、葡萄糖、淀粉有效活菌数分别为2.91、4.1、5.42、4.63（×10 8 CFU·g-l），活菌数残留率为初始活菌数的22%、31%、41%、35%。与对照组相比，添加不同保护剂均有效提高了活菌数的残留率，其中添加葡萄糖保护剂的有效活菌数残留率提高了1.86倍。由此可见，保护剂的添加，对纳豆芽胞杆菌固体粉剂的保藏具有重要影响。

3讨论与结论

本研究首先对纳豆芽胞杆菌的液体培养条件进行初步研究，确定其最适培养温度为40℃，最适培养pH为7.5，在150r.mm_1条件下进行发酵培养18h（对数生长末期），有效活菌数可达13.68×lOs CFU·mL-l。其次，在不同改性条件下，对麦饭石进行处理，确定了经0.5 mol·L-l NaC1溶液改性后麦饭石吸附纳豆芽胞杆菌效果最好，有效活菌数达13.17×lO 8 CFU·g-1，相比未改性前，吸附率提高了13 .3%。最后，考察不同保护剂对纳豆芽胞杆菌固体粉剂保藏期的影响，确定2%的葡萄糖保护剂效果最好，经过6个月保藏期后，其有效活菌数5.42×lO 8 CFU·g-1，有效活菌数残留率达41%，是对照组的1.86倍。

麦饭石表面带有大量阳离子，具有强烈静电引力及离子交换功能;氯化钠溶液作为改性剂，通过钠离子交换，改变了麦饭石表面结构中的阳离子，使麦饭石静电场加强，从而增强了对芽胞杆菌的吸附能力。另外，由于强酸强碱环境会杀死或抑制微生物生长，而偏中性的氯化钠更适合微生物生长，因此，同浓度下盐（氯化钠）改性效果始终高于酸碱（盐酸、硫酸、氢氧化钠）。此外葡萄糖保护剂效果优于糊精及淀粉，究其原因，首先葡萄糖作为小分子保护剂，具有很强的亲水性，分子结构含有3个以上氢键，在干燥过程中，可与芽胞杆菌菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或菌体蛋白质极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构域功能的完整性[17]，其次葡萄糖可作为碳源直接被微生物吸收利用，为微生物提供一定的营养，保证芽胞杆菌在干燥的保藏环境中仍能維持一定的生长，使其保藏初期固体菌剂有效活菌数有一定幅度的提升，同时在整个保藏期内维持着一定的养分水平，使其活菌数残留率相比对照组明显提升。

有鉴于改性麦饭石对其吸附能力的巨大潜力，在本研究的基础上考虑进一步采用热改性、Mn02改性、稀土镧改性等方法，进一步提升麦饭石吸附能力，制备高效的微生物固体粉剂，同时可用于农牧渔业，医药卫生及食品酿造业等，也可用于日用化学，环境保护等方面，提高其市场应用潜力。

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（责任编辑：吴宇琳）

收稿日期：202007-22初稿：2021-07-02修改稿

作者简介：陈龙军（ 1983-），男，硕士，助理研究员，主要从事微生物菌剂、酶工程及发酵工程研究（E-mail：monkeyirene@163com）

通信作者：陈济琛（ 1964-），男，研究员，主要从事微生物菌剂研究（E-mail： chenjichen2001@163 com）

基金项目：福建省农业科学院探索创新项目（ AA2018—13）;福建省科技计划区域发展项日（2019Y3005）;福建省科技计划公益类专项（2018Rl022—

7）、（2019Rl025-4）：围家重点研发计划项目（2018YFD0200706）