贵州两种乳菇的鉴定及同源性分析

易筑刚 陈春旭 陈华 刘明理

摘要：【目的】鉴定贵州两种松乳菇近缘乳菇，为贵州省乳菇近源种鉴定提供方法。【方法】以马尾松Pinusmassonzana林下生长的两种与松乳菇近似的乳菇为研究对象，使用形态学和rDNA ITS区段核苷酸序列分析相结合的方法进行分析鉴定。【结果】两种乳菇分别属于鲜艳乳菇Lactarius vividus和红汁乳菇L hatsudake，两种乳菇在形态学和分子序列上存在一定差异;与松乳菇的同源性分别达95%和93%，在形态特征以及生物、生态学特性上具有极高相似性。【结论】从形态学和分子水平上对贵州鲜艳乳菇、红汁乳菇等进行鉴定，为外生菌根类珍稀食用菌驯化以及保育促产技术的研究与推广应用提供参考依据。

关键词：鲜艳乳菇;红汁乳菇;rDNA ITS序列;同源性;保育促产

中图分类号：Q 93

文献标志码：A

文章编号：1008-0384（ 2021） 07-076605

Identification and Homology of Two Varieties of Lactarius Found in Guizhou

YI ZhugangI， CHEN Chunxu l， CHEN Hua l， LIU Mingli2

（1.Zunyi Academy of Forestry，Zunyi，Guizhou 563000，China;2 Gaotai Town Forestry Station，

Meitan Counly，zunyi，Guizhou

564111，China）

Abstract： 【Objective】 Two varieties closely related to Lactarius delicious found in the wild in Guizhou weremorphologically and molecularly identified and homology analyzed. 【Method】 Two species of Lactarius from a Pinusmassoniana forest in Hejiang Village，Meitan County were examined on their morphological features under a microscope andon their phylogenetic characteristics by ITS rDNA sequence.【Result】The two mushroom varieties were identified to be Lvividus and L.hatsudake.Between them，significant discrepancies in morphology and ITS phylogeny were evident. L vividuswas 95%homologous with L deliciosus，while L hatsudake slightly lower at 93%. 【Conclusion】The information provideda concrete basis for the species identification facilitating the conservation. domestication， research. and utilization of the rareand valuable Lactarius in the wild.

Key words： Lactarius vividus; Lactarius hatsudake; rDNA ITS sequence; phylogeny; conservation and production promotiontechnology

0 引言

【研究意义】乳菇类真菌属于担子菌亚门Basidiomycotina、层菌纲Hymenomycetes、伞菌目Agaricales、红菇科Russulaceae、乳菇属Lactarius，是一类很有开发价值的大型真菌。目前中国有约40种食用乳菇，绝大多数是外生菌根真菌[1]，尤其是马尾松林下着生的乳菇类，如松乳菇Lactariusdeliciosus、橙黄乳菇 L.akahatsu、红汁乳菇 L.hatsudake、鲜艳乳菇 L.vividus、血色乳菇 L.sanguifluus、油味乳菇 L.quietus，横断乳菇 L.hengduanensis等[2]，因其味道鲜美，营养丰富，是一种天然、无公害的珍贵野生食用菌，被视为山中珍品，市场需求度高，销售价格可达50～60元.kg-l，加之该类真菌对松林生长有重要的促进作用，因此除对其分布的立地条件和生态环境进行研究外，对不同地区分布的乳菇种类鉴定以及相互间遗传特性的研究，是认识和科学利用乳菇的前提[3]。【前人研究进展】马尾松林在我国分布极其广泛，生态环境千差万别，导致不同地区甚至同一区域不同生境同一种乳菇在形态特征上存在一定差异，从而出现一度将马尾松林下与松乳菇相似的乳菇类统称为松乳菇的现象。随着研究手段和先进技术的应用，基于形态学特征和分子生物学技术对乳菇种进行精确鉴定，并通过系统发育树的建立解析遗传特性的研究方式已实现。如陈玉华等[4]通过对松乳菇ITS序列比较及其在乳菇屬中的系统发育分析结果表明，松乳菇和红汁乳菇、橙色乳菇亲缘关系较近。由此为乳菇种类的鉴定、遗传特性研究提供了科学方法。ITS（ internal transcribed spacer）是介于18S和26S之间的非编码内转录间隔区，包含一个5.8S编码区。研究表明，ITS片段的进化速率是18S rDNA的10倍，具有进化速率快的特点，此外，还具备片段长度小（真菌ITS区域长度一般在650—750 bp）、易于分析[5]等优点。保守性基本上表现为种内相对一致，种间差异比较明显，近年来被广泛应用于解决较低分类单元层次上的真菌系统发育问题[6-7]，包括近缘属间关系、属下种间或种内群体的系统进化关系。【本研究切入点】笔者白2017年对贵州省马尾松林下常见的两种乳菇的分布、发生期和生态环境进行了多次野外调查，发现其与松乳菇形态相近，但在形态学和分子生物学上存在差异。【拟解决的关键问题】本研究从形态学和分子生物学对贵州两种松乳菇近源种进行区分，利用ClustalX、MEGA6.06等生物信息学软件对两种乳菇进行ITS序列对比分析，判断两者之间以及与松乳菇的亲缘关系，为贵州常见的两种乳菇分别制定保育促产技术及人T驯化提供参考依据。

1材料与方法

1.1子实体来源

子实体标本（子实体1和子实体2）采集于湄潭县高台镇合江村试验基地（采集地地理坐标：海拔831.5 m，经度107°221'77"E，纬度27°39'30"N）。

1.2子实体形态学观察和描述

形态特征依据新鲜标本记录，子实体照片使用Iphone 6s Plus手机拍摄（关闭闪光灯模式下拍摄），后期照片使用Adobe Illustrator CC 2018裁剪拼图，颜色描述编码参照HTML Color Codes（https：//htmlcolorcodes.com），菌盖、菌柄、菌褶形态类型名称参照杨祥开[8]、王向华等[9]的报道。标本采集后取黄豆大小新鲜子实体组织块，用硅胶干燥，以供分子系统学研究之用，其余在50℃彻底烘干。

1.3 DNA的提取、序列扩增

DNA提取采用改良CTAB法，基因组DNA和PCR产物的检测均采用1%的琼脂糖凝胶电泳法[10]。ITS序列扩增和测序采用ITS序列的2对通用引物（ ITSIF： 5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3'：ITS2：5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'）[11]，擴增产物经紫外光检测后，切胶纯化回收并送往上海生工生物工程有限公司进行双向测序。

PCR反应体系（25 uL）：10×缓冲液2.5 uL，dNTP（ 2.5 mmoL·L-l）1 uL，引物（10 umoL·L-l）各0.5 uL，Taq酶（5U·uL-l） 0.2 uL，模板DNA（ 500ng·uL-l） 0.5 uL， ddH20 19.8 uL。

PCR反应条件：94℃变性3 mm;94℃变性30 s，55℃退火45 s，72℃延伸1 mm，共30个循环;72℃修复延伸10 min;4℃保存。

PCR扩增产物在含有EB的2%琼脂糖凝胶中电泳（ 80V，3h），将目的条带从琼脂糖凝胶中切下，用Gel Extr action Mini Kit试剂盒回收，具体操作步骤同说明书。将回收纯化后的扩增产物在2%琼脂糖凝胶中电泳（ 80V，3h），分析其浓度。将测得的目的片段序列与在GenB ank中通过blast检索获得的参考序列进行多重对位排列，手动去除排列结果中两端的非对位排列区，获得的序列提交GenB ank数据库。

2结果与分析

2.1形态特征

子实体1：子实体小型至中型，多为散生少簇生。菌盖直径3～8 cm.幼时边沿内卷扁半球形，中间略凹，轮纹明显至无，浅橙黄色，光滑湿黏（图1-A）。大时边沿伸展，伞状至漏斗形，中间凹陷，轮纹明显，浅橙黄色，光滑湿黏;菌折密延生分叉，从幼到大橙黄色（图1一B）;菌柄长3～7 cm，粗1～2 cm，圆柱形至棒状，两端被覆白色粉状物，初内实后松软至中空，近基部略膨大（图1一C）呈浅橙黄色。菇体汁少，伤后渐变铜绿色。

子实体2：子实体小型至中型，多为散生少簇生。菌盖直径3～8 cm，幼时边沿内卷扁半球形，中间略凹，轮纹明显至无，暗灰至浅褐红色，光滑湿黏（图2-A）。大时边沿伸展，伞状至浅漏斗形，中间凹陷，轮纹明显，浅褐红色，光滑湿黏;菌折密延生分叉，从幼到大褐红色（图2一B）;菌柄长2～6 cm，粗1～3 cm，圆柱形至棒状稍弯曲个别基部渐细，两端被覆白色粉状物，初内实后松软至中空，个别基部渐细（图2-C），呈浅褐红色。菇体汁少，伤后渐变铜绿色。

2.2分子系统学分析

选取子实体1和子实体2两种乳菇子实体白测及GenB ank选取并下载的21条乳菇属及1条外群红菇属ITS序列，红菇属的正红菇Russula vinosa作为外类群，采用最大似然法（ Maximum likelihood，MP）重建其系统框架，经bootstrap法，1 000次循环检验系统树的可靠性（图3）。基于ITS区段的核苷酸序列分析结果显示，两个样品位于不同的进化枝上，其中子实体1与鲜艳乳菇三.vividus聚为一支，相似度为98%;子实体2与红汁乳菇 L.hatsudake聚为一支，相似度为94%。结合子实体形态特征，可确定样品子实体1和子实体2分别为鲜艳乳菇 L.vividus和红汁乳菇 L.hatsudake。

以松乳菇 L.deliciosus为参照，比较子实体1（鲜艳乳菇 L.vividus）和子实体2（红汁乳菇 L.hatsudake）相互之间的亲缘关系，选取松乳菇 L.deliciosusDQ116886 ITS序列与鲜艳乳菇和红汁乳菇构建的同源树（图4）可看出，红汁乳菇和鲜艳乳菇与松乳菇的同源性分别达95%和93%.都表现为较高同源性，反映在形态特征以及生物、生态学特性上的极高相似性。

3讨论

两种乳菇均分布于马尾松林下，形态特征、生物生态学特性以及食用口感极为相似，因此传统习惯都将其统称为松乳菇[12]。然而笔者在调查中发现，松乳菇其实分布较少，大部分以鲜艳乳菇和红汁乳菇为主，尤以鲜艳乳菇最多。王云等[13]采用传统形态学分析方法鉴定将湖南松菌松乳菇 L deliciosus正名为红汁乳菇 L.hatsudake，随后，郭亮等[14]基于形态特征和ITS序列分析对湖南松菌再分类鉴定，结果表明湖南省松林中分布最多的4种松菌鉴定结果为乳菇属未知种 Lactarius sp，松乳菇 L deliciosus、橙红乳菇 L.akahatsu和红汁乳菇 L.hatsudake;使用形态学和ITS序列分析相结合的方法不仅在乳菇属中进行分类鉴定研究，且在红菇属也有相关报道。邓春英等[15]对中国南方变绿红菇的近似种类“青头菌”实则为变绿红菇Russula virescens复合群，其余子实体为绿桂红菇R.viridicinnamomea、红边绿菇R.viridirubrolimbata和新种拟壳状红菇R.pseudocrustosa，且我国变绿红菇近似种R.aff virescens与欧洲的变绿红菇R.virescens和北美的小变绿红菇R.parvovirescens均存在一定差异。在课题组调查观察中发现不同的生态环境下生长的同种乳菇，其子实体外部形态也存在差异。因此推论乳菇属也存在类似现象，在今后的研究中，将运用形态学和ITS序列分析相结合的方法针对这一现象进行更深入的研究。

在贵州，鲜艳乳菇和红汁乳菇在立地分布上存在一定差异，二者除在马尾松林下外，鲜艳乳菇L.vividus还在马尾松较少的壳斗科Fagaceae、樟科Lauraceae、桃金娘科Myrtaceae等混交林内普遍分布且出菇较多，而红汁乳菇 L.hatsudake则很少见，说明鲜艳乳菇可能存在宿主转移（ host switch）或者多宿主现象，类似的研究在同属外生菌根菌的松塔牛肝菌属也曾报道[16-17]，同时也印证了在相同立地条件下鲜艳乳菇比红汁乳菇数量多的原因。不过其转移机制、宿主种类的确认等有待进一步研究。根据鲜艳乳菇可能存在宿主转移或多宿主现象，为下一步通过对鲜艳乳菇宿主转移机理的研究，培育周期短、更易栽培的宿主植物，从而实现操作性较强的人工或半人工栽培技术提供参考依据。

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（责任编辑：张梅）

收稿日期：2021-0206初稿;2021-0604修改稿

作者简介：易筑刚（ 1963-），男，高级工程师，研究方向：林下珍稀食药用菌研究（E-mail： 2914728lO@qq.com）

共同第作者：陈春旭（ 1993-），男，硕士，助理工程师，研究方向：林下珍稀食药用菌与分子生物学研究（E-mail： chenchunxul7@163.com）

基金项目：贵州省科技支撑计划项日（黔科合支撑[2017]2515）