转Cp4 epsps基因大豆快速DAS-ELISA检测方法的建立

候吉超　李忠鹏　梁雨欣等

中图分类号：S 565.1.Q 943.2 文献标识码：A DOI： 10.16688/j.zwbh.2020133

草甘膦（glyphosate）又称镇草宁，1971年由美国贝尔德等发现，并由孟山都公司开发生产，目前已成为全球销量最大的除草剂品种。来自土壤农杆菌CP4的epsps基因所编码的CP4-EPSPS蛋白由于对草甘膦具有高抗性而被广泛应用于转基因作物。目前，我国已获得多个转Cp4 epsps基因农作物，包括大豆、玉米、油菜、棉花、甜菜和苜蓿等。中国是大豆原产国，同时也是大豆需求大国，每年我国从美国、巴西、阿根廷等国进口大量转基因大豆，年进口总量由1996年的57万t上升到2019年的8851万t，进口量不断攀升。随着转基因大豆大量进口及其相关产业的不断壮大，转基因大豆的安全问题逐渐引起人们的关注。因此，建立转基因大豆新型快速检测技术显得尤为重要。

目前，转基因作物的检测主要分为核酸检测和蛋白质检测两大类。核酸检测以PCR检测技术为主，此外还相继建立了巢式PCR、荧光定量PCR和Southern-blot等检测技术。PCR检测技术具有特异性强、灵敏度高等特点。蛋白检测主要为血清学检测技术，包括ELISA、双抗夹心ELISA（DAS-ELISA）和斑点ELISA（Dot-ELISA）等检测技术。血清学检测技术具有重复性好、操作简便等特点，对检测环境、仪器要求较低，适合在基层推广应用。在血清学检测的基础上，研究者进一步研制出了胶体金试纸条检测技术，但是对转基因加工制品灵敏度较低。

本研究以CP4-EPSPS单克隆抗体和多克隆抗体为基础，成功建立检测转Cp4 epsps基因大豆快速DAS-ELISA方法，将检测时间由普通DAS-ELISA的150 min缩短至75 mln。通过对检测条件的优化，提高该检测方法的准确性、简便性，实现对转Cp4 epsps基因大豆的快速检测。

1材料与方法

1.1材料与试剂

CP4-EPSPS标准蛋白、CP4-EPSPS特异性单克隆抗体1D12、羊多克隆抗体8092由本实验室制备;非转基因‘Williams和转Cp4 epsps基因大豆‘W-82系列由吉林省农业科学院农业生物技术研究所提供;辣根过氧化物酶（HRP）标记羊抗CP4EPSPS多克隆抗体8092由南京钟鼎生物技术有限公司提供;双组分TMB显色液购于北京索莱宝科技有限公司;脱脂奶粉购于生工生物工程（上海）股份有限公司;HRP标记兔抗小鼠IgG购于Sigma公司。

1.2仪器与设备

BioTek洗板机、BioTek酶标仪购于美国伯腾仪器有限公司;高速冷冻台式离心机购于日本日立公司;恒温培养振荡器购于上海智城分析仪器制造有限公司。

1.3方法

1.3.1快速DAS-ELISA方法的建立

以CP4-EPSPS单克隆抗体1D12为捕获抗体包被96孔酶标板100μL/孔，40C静置过夜，加入5%脱脂奶粉250μL/孔，37℃封闭1h;样品用PBS缓冲液适当稀释后，充分研磨、离心、取上清液，将上清液与检测抗体HRP标记的多克隆抗体8092先后加入96孔酶标板，各50μL/孔，37℃静置孵育1h，以上每一步结束后96孔酶标板用PBST洗3遍，拍干;加TMB显色液90μL/孔，避光显色5～15 min，加入2 mol/L H₂SO₂溶液45μL/孔终止反应。以检测样品OD₁₅₀（P值）/阴性对照OD₁₅₀（N值）≥2.1判定为阳性检测结果。

试验重复3次，同时设置阳性（转Cp4 ep3-ps基因大豆叶片）、阴性（非转基因大豆叶片）、空白（去离子水）3个对照。

1.3.2快速DAS-ELISA方法的优化

以非转基因和转Cp4 ep3-ps基因大豆叶片作为阴性对照和阳性对照，运用建立的快速DAS-ELISA方法进行检测。采用矩阵滴定法优化捕获抗体和检测抗体的工作浓度，以P/N最大值确定抗体工作浓度。运用DAS-ELISA方法分别对捕获抗体孵育时间、待测样品与检测抗体共同孵育时间进行优化，以P/N最大值确定捕获抗体孵育时间，同时分析P/N值，选择合适的样品与检测抗体共同孵育时。

1.3.3快速DAS-ELISA方法检测范围的确定

用PBS将CP4-EPSPS蛋白标准品浓度从160μg/mL等比稀释至0.078 125μg/mL，运用优化后的快速DAS-ELISA方法进行检测，每个浓度3个技术重复，以蛋白浓度为横坐标，P/N值为纵坐标，绘制灵敏度曲线，得出快速DAS-ELISA方法的检测范围。

1.3.4检测材料的优化

根据1.3.3小节的试验结果对大豆叶片和籽粒进行稀释度优化，采集非转基因和转Cp4 epsps基因大豆叶片和籽粒，叶片用PBS缓冲液（1g样品：10 mL PBS）充分研磨后，用PBS缓冲液等比稀释至1：20 000倍;籽粒处理方法同叶片，最终等比稀释至1：640倍;12 000r/min离心5min，取上清液，运用建立的快速DAS-ELISA方法对其进行检测，根据P/N值，得出叶片和籽粒检测时的稀释区间。

1.3.5重复性试验

运用建立的快速DAS-ELISA方法检测转Cp4 epsps大豆葉片和种子各4份，每份材料3个技术重复，测定OD₁₅₀，分别计算板内、板间变异系数。

1.3.6田间样品检测

试验田中随机采集100份大豆植株叶片，用PBS缓冲液从1：10至1：320倍之间随机稀释，充分研磨，12 000r/min离心5 min，取上清液，运用上述建立的快速DAS-ELISA方法对其检测，同时利用Western blot方法检测，以单抗1D12为一抗（1：5000稀释），HRP标记的兔抗小鼠IgG为二抗（1：10000稀释），对比二者检测结果，并运用建立的检测方法对5粒非转基因和15粒转Cp4 epsps基因大豆籽粒进行检测，验证检测方法效果。

1.4数据分析

试验均进行3次重复，数据处理采用SPSS 20.0进行显著性分析和Graphpad Prism 8.0软件进行作图。

2结果与分析

2.1 CP4-EPSPS蛋白快速DAS-ELISA检测方法的建立

采用矩阵滴定法筛选捕获抗体和检测抗体的最佳工作浓度（表1），当捕获抗体工作浓度为10 μg/mL，检测抗体工作浓度为1. 25μg/mL时，P/N值最大，表明在此浓度下检测效果最好，确定其为抗体最佳工作浓度。分别对捕获抗体、待测样品与检测抗体共同孵育时间进行优化，结果如图1所示，捕获抗体最佳包被条件为37℃2h后4℃过夜;据图2所示，当待测样品与检测抗体37℃共同孵育75min时，P/N值最大，但37℃孵育60 min和75 min时P/N值无显著差异，本研究建立的检测方法以快速定性为主，综合考虑，确定样品与检测抗体最佳共同孵育条件为37℃孵育60 min。

1）P/N为检测样品OD₁₅₀/阴性对照OD₁₅₀。 P/N is the ratio of OD₁₅₀between sample and blank control.

2.2快速DAS-ELISA檢测范围的确定

运用建立的快速DAS-ELISA方法对不同浓度CP4-EPSPS蛋白标准品溶液进行检测，建立CP4EPSPS蛋白灵敏度曲线，如图3所示，当CP4-EPSPS蛋白浓度在0.3125～80μg/mL时，检测结果为阳性，即该方法的检测范围。

2.3检测材料的优化

对转Cp4 epsps基因大豆叶片、籽粒蛋白粗提液浓度进行优化，如表2所示，当转Cp4 epsps基因大豆叶片样品稀释10～5000倍时，检测结果呈阳性，且稀释80倍时P/N值最大，因此，确定叶片样品稀释区间为10～80倍;如表3所示，籽粒样品稀释10～320倍时，检测结果呈阳性，为了便于操作，确定籽粒样品稀释区间为10～80倍。在该稀释范围内，检测效果较好，有利于快速定性检测转Cp4 epsps基因大豆。

2.4重复性试验

运用建立的快速DAS-ELISA方法对8份样品进行检测，结果如表4所示，8份样品板内变异系数为1. 64%～5. 42%，板间变异系数为3.05%～9.13%，变异系数均小于25%，表明建立的检测方法稳定性较好，符合ELISA定性试剂盒参考标准。

2.5田间样品检测绪果比较

Western blot检测结果如图4所示，100份检测样品中共计有53份样品出现特异性免疫印迹，快速DAS-ELISA方法检测结果显示（表5），共计检测出53份阳性样品，对比两种方法检测结果，两种检测方法符合率为100%，对20份已知的大豆籽粒进行检测（W代表非转基因大豆，C代表转Cp4 epsps基因大豆），非转基因大豆P/N值<2.1，转基因大豆P/N值≥2.1，与标准结果比较检测符合率为100%（表6）。

3讨论

本研究以非转基因和转Cp4 epsps基因大豆叶片和籽粒作为试验材料对快速DAS-ELISA工作条件进行优化，与使用重组蛋白作为试验材料相比，结果更真实可靠。蛋白免疫印迹杂交（West-ern-blot）是鉴定转基因生物的标准方法，本研究以Western-blot检测结果作为标准衡量快速DAS-ELISA的准确性。对100份大豆样品的检测结果分析发现，本研究建立的快速DAS-ELISA准确率为100%。

为了缩短检测时间，本研究优化了检测方法。首先，检测抗体经HRP标记，省去了酶标二抗的反应步骤：此外，将抗原孵育和检测抗体孵育这两步反应合并为一步进行，进一步减少了检测步骤。检测过程仅需要两步，将检测时间缩短至75 min，目前，国外进口试剂盒检测时间在2. 5～3.5 h之间。本检测方法中，样品孵育超过30 min时，检测结果即呈阳性，因此在实际检测中，孵育30 min可以作为样品与抗体反应最短时间。

在测定DAS-ELISA的检测范围时发现，随着CP4-EPSPS蛋白浓度等比例逐渐降低，P/N值呈现出先上升后下降的趋势，出现这种情况，是因为当蛋白过饱和时，部分蛋白没有结合检测抗体而与捕获抗体直接结合，最终影响P/N值。

综上所述，本研究建立的快速DAS-ELISA方法适用于转Cp4 epsps基因大豆植株和种子的快速检测，为转基因后代材料的精准鉴定和转基因大豆产品的监管提供技术手段，该检测方法是否适用于玉米、水稻等作物还有待于进一步研究。