一例犬皮肤大面积坏死的间充质干细胞水凝胶治疗案例

艾力·艾尔肯，李巴仑，张梦菲，谭 宁，寇 正，张慧敏，吴筱洁，孙亚东，华进联*

(1.西北农林科技大学动物医学院/陕西省干细胞工程技术中心，陕西杨凌 721000；2.辽宁生态工程职业学院，辽宁沈阳 110000)

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种具有自我更新和多向分化潜能的细胞，在抗炎、免疫调节及组织器官再生方面有重要作用[1-4]。MSCs能够合成分泌多种生长因子及营养因子，并可通过旁分泌效应促进其周围的受损细胞及组织修复[5]。已发现的MSCs细胞因子包括血管内皮生长因子(VEGF)、干细胞生长因子(SCF)、血管生成素(Ang)、表皮调节素(epidermin)、内皮素(endothelin)、转化生长因子(TGF)、碱性成纤维细胞生长因子(BF-GF)及抗凋亡因子如半乳糖凝集素3(galectin-3)和分泌型卷曲相关蛋白[6-10]。MSCs上清液可以促进相应细胞的增殖和生长，还可促进人真皮成纤维细胞的生长，进而加速创面的愈合[11-12]。这与MSCs上清液中所含有的各种抗凋亡因子、营养因子、生长因子和其旁分泌作用存在密切的联系。水凝胶是一种稳定的亲水性网络结构，通过物理、化学以及生物酶法交联而成，具有良好的生物相容性、可降解性和保水性，在临床医学中显现出较大的应用潜力。从干细胞上清液功能开发、水凝胶材料选择以及伤口修复机制等方面进行深入探索，将有望使干细胞上清液的水凝胶用于临床治疗皮肤创伤，提高修复效果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞 人脐带间充质干细胞由陕西省干细胞工程技术研究中心储存。

1.1.2 主要试剂 α-MEM培养基，Gibco公司产品；Ultra GROTM(血清替代物)，上海创凌生物科技有限公司产品；TrypLE Express(胰酶替代物)，上海创凌生物科技有限公司产品；卡波姆-940，源叶生物公司产品，甘油，上海梯希爱公司产品；氢氧化钠，上海梯希爱公司产品；Tween 80，上海梯希爱公司产品；尼泊金乙酯钠盐，上海梯希爱公司产品；三乙醇胺，上海梯希爱公司产品。

1.1.3 主要仪器 CO2培养箱，美国Thermo scientific公司产品；超净工作台，北京亚太克隆公司产品；倒置显微镜，尼康公司产品；冷冻干燥机，上海舜制仪器制造有限公司产品；-80度低温冰箱，Haier公司产品；全自动血常规分析仪，美国Bio Tec公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病例概况 2021年4月，宠颐生动物医院沈阳佳缘分院接诊1只黑田园犬，肱骨部有一块约10 cm2皮肤缺失，表面黑硬，皮肤创缘整齐，内部肌肉坏死，边缘毛发粘连，有污浊物混合在一起(图 1)。主诉几天前被其他大犬咬伤，肱骨末端开放性骨折，主人选择使用保守治疗，将伤口缝合。缝合后第3天患犬出现组织坏死，感染及溃烂等症状，此时医生未对患犬做其他检查和处理。

1.2.2 检查诊断 该犬为3月龄黑田园家犬，体重2.35 kg，体温38.4℃，心跳呼吸正常，病犬精神状态、食欲及排粪、排尿未见明显异常。肱骨部位损伤严重，出现不同程度跛行，触摸关节疼痛，结缔组织增生伴随炎症反应等症状，影响患犬正常活动。

1.2.3 实验室检查 由前肢头静脉采血的方式采取病犬血液1 mL进行血常规检测。

1.2.4 间充质干细胞冻干粉制备 间充质干细胞上清液收集培养人间充质干细胞至第2代至第5代；当细胞生长密度到80%～90%时，收集细胞培养上清液，无菌离心，上清液在-80℃冻存备用；通过冷冻干燥机蒸发水分获取干粉。最后制得冻干粉，称重，锡纸包裹，登记，置-80℃保存。

1.2.5 凝胶剂的配制 称取0.1 g卡波姆-940加入适量蒸馏水，充分溶解; 另取0.3 g阿昔洛韦加入到溶解好的基质当中，搅拌分散均匀; 之后加入20 g甘油、5 g乙醇、0.4 g氢氧化钠、0.2 g Tween-80和0.2 g尼泊金乙酯钠盐，搅拌使其分散均匀; 将混合均匀的基质加入三乙醇胺，调节pH至6～7后加蒸馏水至88.3 g，机械搅拌60 min使其充分混合均匀，4℃放置12 h，即得透明凝胶。

1.2.6 治疗方法及预后 使用间充质干细胞冻干粉注射液治疗，肌肉注射(50 mg/kg)，每天1次，连用3 d。同时使用间充质干细胞凝胶(10 g)涂抹在伤口上，连用1周。治疗前后血常规各检查一次。

2 结果

2.1 间充质干细胞冻干粉与凝胶对犬创面愈合效果观察

治疗第0天，组织坏死及溃烂；第1天，开始逐渐结痂，无液体渗出，创面变化明显；第2天，创面无液体渗出，结痂，创面不平整；第3天，伤口开始缩痂，创面呈现暗红色；第4天，伤口结痂部分脱落，疤痕面积变小；第6天，已完全掉痂，创面进一步缩小，开始长出毛发(图1)。

2.2 犬血常规指标的变化

由表1和表2可以看出，治疗前犬的白细胞、红细胞压积及红细胞数均显著高于参考值，同时平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量及血小板数目水平显著低于参考值。联合使用间充质干细胞凝胶和间充质干细胞注射液治疗第7天后犬的白细胞、红细胞压积及红细胞数、平均红细胞体积、平均红细胞血红蛋白含量及血小板数均恢复至标准范围内，结果表明，间充质干细胞冻干粉促进了病犬皮肤创伤愈合并改善了病犬各项生理指征。

表1 治疗前后血常规检查结果

D0.治疗之前；D1.治疗后第1天；D2.治疗后第2天；D3.治疗后第3天；D4.治疗后第4天；D6.治疗后第6天。

3 讨论

皮肤是机体的重要屏障，然而随着宠物饲养数量的增加，各种原因造成的皮肤缺损、难愈性创面及瘢痕的病例也在逐渐增加，给兽医临床治疗带来了很大的挑战[11]。小动物临床上偶有因外伤或其它因素受伤，或因未能及时处理导致皮肤大面积缺损及坏死病例，自然愈合时间久，创口复发感染几率大，现有治疗手段少且缺乏高效的治疗措施。皮肤移植法具有供体皮肤稀缺等不利因素。创面愈合主要的特征包括组织再生、创面再上皮化和创面血管的新生。组织再生缺乏干细胞、促愈合细胞因子以及血管生成减少，都能导致创面愈合困难。通过间充质干细胞分泌因子来促进创面的愈合及大面积软组织损伤后的修复是一个全新思路。干细胞分泌因子能通过自分泌或旁分泌的方式改善受损部的微环境，促进机体内源性干细胞向受损部位的迁移并分化，拯救即将坏死的细胞，从而达到修复组织的目的[12-14]。它还是一种可以把被动的机体自我修复转换为主动可控的外界治疗手段[15]。经过本病例犬的治疗证明，间充质干细胞冻干粉局部注射和间充质干细胞凝胶涂抹对皮肤创伤炎症有很好的抑制作用，同时能提高犬创面愈合率。由此可以看出，间充质干细胞冻干粉与凝胶对皮肤愈合有良好的效果。