基于网络药理学探究黄芩汤治疗猪腹泻的作用机制

2021-11-12崔恩慧赵善廷

动物医学进展 2021年11期

崔恩慧，赵善廷

(西北农林科技大学动物医学院，陕西杨凌 712100)

黄芩汤源自《伤寒论》，由黄芩、白芍、大枣、甘草4味中药组成。方中黄芩味苦，性寒，清热止痢，可清太阳和少阳经之热；白芍味苦、酸，性微寒，和营止痛；大枣味甘，性温，补脾和胃，益气生津；甘草性平，味甘，补脾益气、调和诸药。4味药合方共奏清热止痢、和中止痛之效。黄芩汤治疗胃肠道疾病已有数千年历史[1]。大量药理研究表明，黄芩汤活性成分具有抑制细菌生长[2]、抗炎[3]、调节免疫[4]、抑制肿瘤[5]等作用。类黄酮是黄芩中的主要成分，具有抗炎、抗病毒和调节免疫系统的作用[6]。白芍中的总苷也有抗炎和免疫调节作用[7]。甘草中的黄酮、三萜皂苷和异黄酮衍生物具有抗炎、抗癌和抗氧化作用[8]。枣中的三萜和多糖具有抗炎和免疫生物学活性[9]。研究表明，黄芩汤对猪腹泻也有很好的疗效，但其治疗机制尚未见报道。为了探索黄芩汤治疗猪腹泻的作用机制，本研究采用网络药理学方法全面探究了黄芩汤治疗猪腹泻的潜在作用机制，为黄芩汤在治疗猪腹泻中的临床应用提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 黄芩汤活性化合物-靶点网络图的构建

本研究通过中药系统药理学分析平台(TCMSP)[10]检索了黄芩汤中4味中药的化学成分，根据口服利用度(oral bioavailability,OB)≥50和类药性(drug-likeness,DL)≥0.18对所有单味药化合物进行初步筛选[11]。筛选结束后，通过PharmMapper[12]对相关活性成分作用靶点进行预测。利用Cytoscape3.8.2构建化合物-靶点网络，探究黄芩汤治疗疾病的作用机制。

1.2 猪腹泻靶点检索

将“Susscrofa”和“diarrhea”作为关键词，在NCBI数据库Gene中检索猪腹泻靶点。

1.3 PPI网络构建和关键靶点筛选

通过BisoGenet插件，将黄芩汤靶点和猪腹泻疾病靶点分别映射到PPI网络，同时利用Cytoscape3.8.2对两个PPI取交集，获得黄芩汤和猪腹泻的交集网络。

采用网络拓扑分析插件Cyto NCA[13]对交集网络进一步筛选，选出度值大于所有节点度值2倍中位数的节点，即“Big hubs”；筛选网络中的关键节点，再筛选其他几个指标大于所有节点中位数的节点，即关键基因。上述获得的相关化学成分及靶点则有可能是黄芩汤治疗猪腹泻的直接或间接作用环节。

1.4 靶点GO富集及KEGG通路富集分析

通过David在线数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO富集分析和KEGG通路富集分析，利用Cytoscape3.8.2构建靶点-信号通路网络。

2 结果

2.1 黄芩汤有效成分的筛选

从TCMSP中检索黄芩汤的化学成分，确定筛选条件后最终收集黄芩汤有效成分65个(黄芩7个、白芍7个、大枣9个、甘草42个)，去除单味药重复成分后共获得62个活性成分。根据活性成分来源进行重命名，黄芩的第1个成分重命名为HQ1，第2个成分重命名为HQ2，黄芩、白芍、大枣中共有的成分重命名为A1，白芍、大枣中共有的成分重命名为B1。

2.2 黄芩汤活性成分靶点的收集和筛选

将黄芩汤活性成分通过PharmMapper预测靶点，得到黄芩靶点36个，白芍靶点106个、大枣靶点61个、甘草靶点81个，合并后删除重复值共得到121个靶点。将结果导入cytoscape3.8.2软件，构建黄芩汤有效成分-靶点网络(图1)。如图1所示，化合物-靶点网络共包括61个化合物节点、121个靶点节点和1 328条边，黄芩、白芍、大枣和甘草的化合物由六边形节点代表，A1为白芍、大枣和甘草的共同化合物，B1为白芍和大枣的共同化合物，菱形节点代表靶点，节点大小与度值成正比。在黄芩汤治疗猪腹泻网络中，具有较大度值的化合物包括MOL001924、MOL001918、MOL000211、MOL004810和MOL004863，见表1。

六边形节点分别代表黄芩、白芍、大枣和甘草的化合物，A1为白芍、大枣与甘草的共同化合物，B1为白芍和大枣的共同化合物，菱形节点代表靶点。

表1 黄芩汤度>35的活性化合物基本信息

2.3 黄芩汤治疗猪腹泻的PPI构建与关键靶点筛选

2.3.1 黄芩汤治疗猪腹泻的蛋白相互作用将药物靶点和猪腹泻靶点分别输入BisoGenet插件获得PPI网络，对两个PPI取交集，获得黄芩汤和猪腹泻的交集网络见图2。

图2 黄芩汤-猪腹泻交集网络图

2.3.2 黄芩汤治疗猪腹泻的关键靶点通过Cyto NCA对黄芩汤治疗猪腹泻的PPI交集网络进行分析，筛选条件为度值大于70(2倍中位数)得到Big hubs，再通过连接度、介度、紧密度、局部边连通性和网络中心性的中位数进一步筛选得到黄芩汤治疗猪腹泻直接或间接作用的55个关键节点。筛选策略示意图见图3。将55个关键节点导入到String11.0数据库中分析PPI，如图4A，导出表格文本输出(.tsv)，然后导入Cytoscape(3.8.2)绘制目标交互的网络图。节点的大小和颜色与度数成正比，节点越大，颜色越深，它在网络中的重要性就越大；连线的粗细和颜色与度数成正比，线越粗、颜色越深与其有关系的靶点越多，如图4B。为了更好地理解黄芩汤治疗猪病的作用机制，根据节点的度绘制的前18个靶点蛋白的条形图见图5。由图5可知，黄芩汤与猪腹泻靶点中核仁磷酸蛋白(NPM1)、热休克蛋白5(HSPA5)、真核翻译延伸因子1A1 (EEF1A1)、核不均一核糖核蛋白A1(HNRNPA1)等互作的频率较大。

连接度( Degree) 、介度( Betweenness) 、紧密度( Closeness) 、局部边连通性( Local average connec-tivity，LAC)和网络中心性( Network centrality，NC)。

A.关键靶点PPI网络图；B.黄芩汤治疗猪腹泻关键靶点的相互作用网络。A.PPI network diagram of key targets.B.Interaction network of targets for Huangqin decoction against diarrhea of Sus scrofa.

图5 PPI网络图中关键靶点的度

2.4 生物功能和途径的富集分析

为了进一步探讨黄芩汤治疗猪腹泻的作用机制，将55个关键节点导入David数据库。对黄芩汤治疗猪腹泻的靶点进行GO富集(图6)和生物通路分析(图7)。图6显示，在GO富集分析的生物过程中，黄芩汤对翻译、凋亡过程的负调控有很大的影响。在细胞成分中，黄芩汤对细胞外泌体、细胞膜、黏着斑、核仁有影响。在分子功能中，黄芩汤对RNA结合蛋白、核糖体的结构成分、核苷酸的结合影响较大。图7显示黄芩汤治疗猪腹泻的1条通路核糖体通路。具体参数见表2。

表2 KEGG信号通路信息(错误率<0.05)

3 讨论

网络药理学是各种信息学方法的整合，可以从药物成分-靶点-疾病多角度分析，全面系统地探索药物对疾病的作用机制，与中药治疗疾病的整体性和系统性一致。本研究通过TCMSP平台，根据口服利用度和类药性参数，从中药数据库中筛选出黄芩汤有效成分，对有效成分进行潜在活性成分和作用靶点的关系网络绘制，得到可能的靶点。

1.翻译；2.翻译调控；3.凋亡翻译负调控；4.翻译正调控；5.平滑肌细胞增殖调控；6.DNA修复；7.通过非同源端连接修复双链断裂；8.纺锤体组装；9.粘着斑；10.细胞膜；11.胞外外泌体；12.细胞质核糖核蛋白体；13.转录因子复合体；14.核仁；15.胞质小核糖体亚基；16.胞质大核糖体亚基；17.催化第二步剪接体；18.核染色体，端粒区；19.纺锤体极中心体；20.cop9信号体；21.多核糖体；22.多聚(A) RNA 结合；23.核糖体的结构组成；24.RNA结合；25.核苷酸结合；26.泛素蛋白连接酶结合；27.转录辅激活因子活性

黄芩汤主要活性成分为芍药苷、黄芩素、甘草素等黄酮化合物，它们在止泻、抑菌、抗炎等方面有不同程度的药理作用。芍药苷可抑制软骨细胞炎症及延缓软骨退变，还可以减轻小鼠溃疡性结肠炎。黄芩素有抗肿瘤作用[14]，对金黄色葡萄球菌和大肠埃希氏菌都有抗菌活性[15]，然而黄芩素口服利用度为33.52，由于不符合筛选条件而没有入选。甘草中黄酮类化合物大部分具有较高抑菌活性[16]，甘草素可抑制小胶质细胞在LPS刺激下的炎症反应[17]，保护LPS诱导的软骨细胞增殖，并抑制其凋亡[18]。根据以上结果可知，黄芩汤的有效成分之间存在协同，而协同调控的靶点也在腹泻的发生、发展中发挥不同作用，具有治疗腹泻的潜力。PPI分析表明，黄芩汤治疗猪腹泻关键靶点主要是NPM1、HSPA5、EEF1A1、HNRNPA1等。研究显示，核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)基因突变是急性髓系白血病中最常见的分子遗传学异常[19]。热休克蛋白5(HspA5)是一种内质网应激的关键因子，主要通过内质网应激途径参与炎症性肠病的进程[20]。真核翻译延伸因子1A1(eEF1A1)是真核细胞中高度保守的GTP结合蛋白，在蛋白质合成过程中起着重要作用[21]。核不均一核糖核蛋白A1(HNRNPA1)主要参与病毒侵染和应激恢复[22]。在KEGG通路富集中发现1条信号通路，为核糖体信号通路，它与黄芩汤中的核糖体蛋白S4(RPS4X)、核糖体蛋白S3(RPS3)、核糖体蛋白L24(RPL24)、核糖体蛋白L13(RPL13)、核糖体蛋白S3A(RPS3A)、核糖体蛋白S2(RPS2)和核糖体蛋白L7(RPL7)有关。