新疆某种鸡场蛋鸡沙门氏菌分离鉴定及耐药性分析

苏战强，马晓玉，张 毅，张 凌，艾柯代·吐鲁洪，佟盼盼

(新疆农业大学动物医学学院，新疆乌鲁木齐 830052)

鸡白痢和鸡伤寒分别是由鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌引起的，是严重危害我国种鸡健康的两大沙门氏菌病，两者都可以导致家禽出现败血症、白痢，可垂直传播[1-2]。一般情况下，鸡白痢沙门氏菌多侵害幼雏，发病鸡群最高死亡率可达100%，而鸡伤寒沙门氏菌病则主要发生于青年鸡和成年鸡，感染鸡病死率与菌株的毒力有关，病死率一般为10%～25%[3-5]。

目前，鸡白痢和鸡伤寒仍然是危害我国养禽业健康发展的重要传染病，尤其是针对种鸡场和孵化场[6]。我国地方种鸡鸡白痢和鸡伤寒净化不彻底，被感染的种鸡产蛋带菌率约为33%，种蛋污染并被逐代放大，造成的经济损失严重[7-8]。在无法净化的情况下，许多鸡场都用药物进行防控，使得沙门氏菌的耐药性日趋严重，不但危害家禽业的健康发展，同时威胁人类的健康[9]。

2019年1月，新疆米泉某种鸡场鸡群出现产蛋率低，雏鸡成活率低，不断出现零星死亡现象，怀疑发生沙门氏菌感染。为查明该鸡场沙门氏菌的感染情况，本研究采用平板凝集试验法对该鸡场种鸡和商品蛋鸡进行了鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌病血清学调查，采集肛拭子进行沙门氏菌的分离鉴定，确定感染菌的类型以及耐药性情况，以期为沙门氏菌感染的防控提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要试剂 鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原(配套平板凝集实验卡)，北京赛诺利康生物技术有限公司产品；BHI肉汤(HB8478)、BPW(HB4084)、RVS肉汤(HB4198)、HE琼脂(HB4093)、三糖铁琼脂培养基(HB4088-2)，青岛海博生物科技有限公司产品；沙门氏菌显色培养基(CRM004)，广东环凯微生物科技有限公司产品；细菌微量生化反应管、药敏纸片，杭州滨和微生物试剂有限责任公司产品；2×TaqPCR Green Mix，上海生工生物工程技术服务有限公司产品。引物均由北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司合成。

1.1.2 主要仪器 PCR扩增仪(GSX1)，美国Eppendorf公司产品；电泳仪(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司产品；凝胶电泳成像系统，美国Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 样品采集 2019年1月，对新疆米泉某鸡场537只拜城油鸡进行沙门氏菌血清学筛查，包括蛋鸡453只、种鸡84只。采集平板凝集试验强阳性鸡的肛拭子55份。

1.2.2 平板凝集试验 参考鸡白痢鸡伤寒多价染色平板凝集试验抗原说明书的方法操作，用移液枪吸取抗原50 μL，垂直滴于平板凝集试验卡上，再使用兽用9号针头将鸡的翅静脉刺破，用移液枪吸取50 μL血液与抗原混合均匀，并涂散至直径约2 cm的液面。2 min内读取结果，血清出现100%凝集为强阳性，血清出现50%凝集为弱阳性，血清不发生凝集为阴性。

1.2.3 细菌分离培养 将平板凝集强阳性的鸡肛拭子分别置于BPW中预增菌，37℃培养12 h，再转种于RVS选择性增菌液中，34℃培养过夜，划线接种于HE琼脂平板和沙门氏菌显色培养基，37℃培养18 h。挑取3～5个典型单菌落进行革兰氏染色镜检。

1.2.4 分离菌株的鉴定 首先进行生化鉴定，将新鲜的单菌落接种于细菌微量生化反应管，37℃培养24 h，观察记录试验结果；然后进行PCR鉴定，把分离株接种至肉汤培养基，37℃培养12 h后，通过煮沸法提取DNA制备模板。PCR扩增沙门氏菌特异性invA基因，长度为202 bp[10]。PCR总反应体系25 μL：2×TaqPCR Green Mix 12 μL，ddH2O10 μL，上、下游引物各1 μL，细菌DNA模板1 μL。

反应参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃延伸10 min。扩增产物在12 g/L琼脂糖凝胶中电泳，通过凝胶成像分析系统观察结果。

1.2.5 分离沙门氏菌的血清分型 根据文献[11]设计合成扩增ratA基因的引物，通过基因组差异区(ROD)来辨别鸡伤寒或鸡白痢沙门氏菌。用此引物扩增分别产生两种单一产物，1 047 bp条带判定为鸡伤寒沙门氏菌，243 bp条带判定为鸡白痢沙门氏菌。反应参数：94℃预变性3 min；然后94℃变性1 min，63℃退火30 s，72℃延伸 60 s，共25个循环；72℃延伸5 min。PCR产物在10 g/L琼脂糖凝胶中电泳，然后进行成像分析。

1.2.6 分离菌的药敏试验 采用CLSI推荐的K-B法对分离株进行18种抗生素的药物敏感性检测。先将菌株接种在MH肉汤中，37℃培养12 h后，调整菌悬液至0.5麦氏浊度，用灭菌棉签均匀涂布在MH平板上，再贴药敏片，37℃培养18 h，用游标卡尺测量抑菌圈直径并记录，参照CLSI标准判定结果。

表1 本研究中用到的引物

2 结果

2.1 平板凝集试验结果

该种鸡场的鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌病抗体阳性率为19.6%(105/537)，蛋鸡和种鸡阳性率分别为20.5%(93/453)和14.3%(12/84)(表2)。平板凝集试验强阳性鸡有55只，共采集肛拭子样品55份。

表2 不同用途鸡白痢和鸡伤寒沙门氏菌病的血清学检测结果

2.2 细菌分离培养

分离培养共得到3株疑似菌，他们在HE琼脂上形成墨绿色、中心呈黑色的菌落(图1)；疑似菌在沙门氏菌显色培养基上呈紫色、表面光滑、露珠样的菌落(图2)。取单菌落进行镜检，可观测到革兰氏阴性短杆状菌体(图3)。

图1 分离菌株在HE上的菌落形态

图2 分离菌株在沙门氏菌显色培养基上的菌落形态

图3 分离菌革兰氏染色结果(100×10)

2.3 分离菌株的鉴定

生化鉴定结果(表3)显示，3株分离菌的生化鉴定反应均为三糖铁斜面产碱、底层产酸、不产气、产硫化氢；赖氨酸脱羧酶、卫矛醇反应阳性，枸橼酸盐利用试验阳性；尿素，氰化钾、山梨醇、水杨素、色氨酸、鸟氨酸脱羧酶、丙二酸盐和OPNG反应均阴性。结果显示，与《伯杰氏细菌鉴定手册》中禽伤寒沙门氏菌的生化结果一致，因此初步确定分离菌株为禽伤寒沙门氏菌。

表3 分离菌株生化实验结果

PCR鉴定结果显示，3株分离菌invA基因阳性(图4)，因此确定3株分离菌均为禽沙门氏菌。沙门氏菌分离率为5.5%(3/55)。

M.DNA标准DL 2 000；-.阴性对照；+.阳性对照；1～3.分别为3株分离菌株培养物invA基因的PCR扩增产物。

2.4 分离沙门氏菌的血清分型

PCR血清分型结果显示，3株菌均可扩增出1 047 bp目的条带(图5)，因此确定3株分离菌均为鸡伤寒沙门氏菌。

2.5 分离沙门氏菌的药敏试验

在3株鸡伤寒沙门氏菌中，有1株菌(XJMQ-S39)呈多重耐药表型，该菌对β-内酰胺类(头孢噻肟、氨苄西林、氨曲南、哌拉西林和氯霉素)、磺胺类(磺胺甲基异恶唑)、四环素类(四环素)、氨基糖苷类(链霉素)和喹诺酮类(环丙沙星)耐药，对左氧氟沙星和多黏菌素B呈中度敏感，对头孢吡肟、头孢他啶、庆大霉素、阿米卡星敏感。其余2株对多黏菌素B均呈中度耐药，对其他药物均敏感。

M.DNA标准DL 2 000；-.阴性对照；1～3.分别为3株分离菌株培养物ratA基因的PCR扩增产物。

3 讨论

鸡沙门氏菌病是家禽最常见的传染病之一，种禽场主要通过垂直传播感染鸡沙门氏菌，导致种鸡场鸡群的生产性能下降，种蛋污染并被逐代放大[12]。在不同地区和不同环境因素作用下，养禽场鸡沙门氏菌病的阳性率存在一定差异。王政等研究表明，惠州地区不同县(区)养禽场沙门氏菌病的抗体平均阳性率为8.30%，种禽场阳性率为5.17%[13]。林晴等研究显示，福州地区种禽场的抗体平均阳性率为17.89%[14]。广东部分地区种鸡群鸡白痢平均阳性率为40.6%[15]。本研究对新疆米泉某鸡场沙门氏菌病的调查发现，血清抗体阳性率为19.6%(105/537)，高于惠州和福州等地，可能影响了该鸡场鸡群的生产性能。近10年来，这是首次报道新疆种禽场沙门氏菌病血清学的流行情况，为我国禽沙门氏菌病血清学调查提供了数据资料。

测定家禽中沙门氏菌血清型的多样性，有助于兽医和公共卫生当局制定预防战略，控制家禽中的沙门氏菌病，降低经济损失，有助于阻止这些血清型向人类传播[16]。本研究血清学检测所用的沙门菌抗原为鸡白痢鸡伤寒多价染色抗原，但由于鸡白痢沙门氏菌和鸡伤寒沙门氏菌都属于D血清群，具有相同的O抗原，为了明确其生物型，本研究借助PCR手段进一步进行血清分型，从55只血清抗体呈强阳性的鸡肛拭子中，分离得到了3株鸡伤寒沙门氏菌。对于抗体阳性而病原阴性的鸡只，不排除隐性感染的可能[17]。鸡伤寒沙门氏菌是困扰养禽业的重要细菌性病原之一，受污染的家禽及其产品可引起人的沙门氏菌病，已成为一个公共卫生问题[18]，评估家禽中沙门氏菌的分布对于更好地防治沙门氏菌病显得十分重要[19]。

我国很多地方的种鸡场，尤其是小型企业尚不能通过淘汰措施实现净化防控，原因是净化难度大，操作周期长，经济损失严重。为降低鸡沙门氏菌病的危害，大多数种鸡场选择依靠抗菌药物，长期用药，甚至不规范用药使得禽沙门氏菌的耐药性不断增强[20]。近年来，我国各地禽源沙门氏菌的耐药现象较严重，多重耐药菌株也不断增加。沈学怀等报道，在安徽地区种禽场中多重耐药的禽源沙门氏菌占比97.62%[21]。陆彦等报道，山东省种禽场沙门氏菌的多重耐药率为91.0%[22]。本研究中，鸡伤寒沙门氏菌分离株XJMQ-S39表现为多重耐药，并对常用的四环素、氨苄西林、链霉素等抗菌素耐药，这与Alam报道的养禽场中多重耐药沙门氏菌的耐药情况一致[23]。值得注意的是，本研究中3株鸡伤寒沙门氏菌都对多黏菌素B呈中度耐药。多黏菌素是一种对革兰氏阴性菌具有强大抗菌作用的环状多肽类抗生素，很可能成为未来治疗多重耐药菌感染的最佳选择[24]，所以在实践生产中必须谨慎使用。

由于禽沙门氏菌病严重影响鸡的生产性能，给养鸡业造成了重大经济损失。所以，本试验通过平板凝集试验、沙门氏菌的分离鉴定以及耐药性检测，明确新疆米泉某鸡场沙门氏菌病的流行情况。禽沙门氏菌已出现多重耐药表型，建议慎用耐药率高的抗菌药物，以减缓细菌耐药性的产生。