鸡p53 mRNA实时荧光定量PCR检测方法的建立及应用

佟美姣，高雪丽，郑世民*

(1.东北农业大学，黑龙江哈尔滨 150030；2.宝清县动物疫病预防与控制中心，黑龙江省双鸭山 155600)

p53基因在机体内有多种作用，能够调控细胞周期，修复损伤DNA，抑制肿瘤发生，维持基因稳定。各物种之间保守区序列为DNA结合域的氨基酸主要的突变区域集中在编码区为5-8外显子[1]。1988年，鸡p53基因从脾细胞cDNA文库中被克隆出来，与人P53蛋白有47%相似性[2]。研究表明，在鸡体内p53的过量表达能够抑制新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒复制[3-4]，起到保护的作用。检测p53基因的方法很多，有DNA测序、色谱法、免疫组织化学、变性梯度凝胶电泳法、生物芯片、高分辨率溶解曲线技术、高通量基因测序等[1,5]，但是应用在鸡体内研究的方法较少。荧光定量PCR敏感性高，特异性和重复性好，应用到多种基因检测中效果良好[6]。根据目前研究的结果，本文将建立一种应用于检测鸡p53 mRNA的实时荧光定量PCR方法，希望能更加精确检测禽类p53 mRNA的表达，为之后的相关研究打下良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 SPF鸡，21日龄，品种CSIRO-MVS，购自哈尔滨兽医研究所。

1.1.2 毒株 传染性法氏囊病病毒(IBDV)强毒(J1C7)株，购自中国兽医药品监察所。

1.1.3 主要试剂 质粒DNA小量试剂盒，爱思进生物技术(杭州)有限公司产品；M-MLV Reverse Transcriptase，Promega(美国)公司产品；Oligo(dT)15，天根生物(北京)有限公司产品；SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ，宝生物工程(大连)有限公司产品；TrizolLS Reagen，Invitrogen(美国)公司产品；感受态细胞DH5α、pMD18-T载体，TaKaRa(大连)公司产品。

1.1.4 主要仪器 荧光定量PCR仪(LightCycler2.0)，美国罗氏公司产品；PCR仪(PTC-200)，美国BIO-RAD公司产品；凝胶成像系统(GDS-800)，美国UVP公司产品；电泳仪(DYY-6C)，北京六一生物科技有限公司产品。

1.1.5 相关引物 参考GenBank发表的鸡p53相关序列，利用相关软件设计引物，p53引物(基因序列号NM205264)P1：CCCATCCTCACCATCCTTACA，P2：CTCGATCTTGCGGTCCCTC，片段长度108 bp；β-actin引物参照已经发表的文献[7]进行合成(基因序列号AW61617)，β1：TGAAGCCCAGAGCAAAAGAGGTAT，β2：TGCTCCTCAGGGCTACTCTC，片段长度135 bp。

1.2 方法

1.2.1 动物分组 98只21日龄SPF雏鸡随机分为对照组(C组)与病毒感染组(I组)，分别进行如下处理：C组(44只)，雏鸡于21日龄经滴鼻、点眼给予灭菌PBS，100 μL/只；I组(54只)，雏鸡于21日龄经滴鼻、点眼感染IBDV稀释液，100 μL/只。

1.2.2 合成DNA模板 采用Trizol试剂，提取鸡免疫器官中的总RNA，所得产物用20 μL DEPC水保存。总RNA通过琼脂凝胶电泳，利用紫外分光光度仪进行分析，计算OD260 nm、OD280 nm值，通过其比值对所提取的RNA进行鉴定。质量良好完整的RNA，进行反转录，所得cDNA保存备用。

1.2.3 目的片段扩增 建立PCR反应体系：上、下游引物(P1/P2、β1/β2，10 μmol/L)各0.5 μL，制备的cDNA 2.0 μL，EasyTaq(5 U/μL)0.1 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol/L)2.0 μL，ddH2O 17.5 μL，10×PCR buffer 2.5 μL。

反应程序如下：预变性94℃ 5 min；变性94℃ 30 s，退火p53引物55℃，β-actin 引物58℃[7]，均是30 s；延伸72℃ 30 s；30个循环；终延伸72℃ 10 min。电泳观察PCR产物。

1.2.4 标准品的制备 按照试剂盒的说明对PCR产物进行回收，经过纯化后，把p53、β-actin扩增产物与载体pMD18-T链接。链接的产物转化至感受态细胞DH5α，通过PCR鉴定以及基因序列测定，提取鉴定为阳性克隆株的质粒，保存备用。

1.2.5 优化反应条件 利用普通PCR对试验条件进行优化，例如引物浓度、模板用量及退火温度，通过多次的PCR反应，对所需要的条件进行摸索，寻找最优组合方案，进行试验。

1.2.6 制作标准曲线 本试验是以所提取的重组阳性克隆质粒稀释品为模板，利用设计的鸡p53、β-actin引物，进行Real -Time PCR扩增，制作标准曲线。用p53、β-actin基因阳性克隆质粒进行10倍梯度稀释：100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9。

试验所用的反应体系为20 μL：阳性质粒2.0 μL，PCR Forward Primer(10 μmol/L)0.8 μL，lPlatinum SYBR Green qPCR SuperMix-UDG(2×)10.0 μL，PCR Reverse Primer(10 μmol/L)0.8 μL，灭菌ddH2O补足。

试验程序为：预变性95℃ 2 min；变性95℃ 20 s，退火55℃ 20 s，延伸72℃ 10 s，45个循环，在每次运行退火之后采集荧光信号。每次试验均设置阴性对照品。反应完成后，确定反应的扩增曲线、熔解曲线并制作标准曲线，利用分析软件自动进行数据处理。

1.2.7 重复性试验 为判定扩增反应的特异性，以p53、β-actin 重组阳性质粒做10倍梯度稀释，即100～10-9，每稀释度的样品做3次重复性试验。根据每次试验的相应熔解曲线进行判断。

1.2.8 所建检测方法的应用 方法建立后，以21日龄SPF雏鸡为研究对象，分别对IBDV感染雏鸡和未感染雏鸡的法氏囊、胸腺及脾脏中的p53 mRNA表达进行real-time PCR检测。

1.3 数据处理

采用SPSS软件进行数据处理，比较组间差异。所有数据均以“平均值±标准差”表示。

2 结果

2.1 总RNA电泳结果

对所提取的鸡免疫器官的总RNA样品进行质量鉴别，经过琼脂糖凝胶电泳，所得到的图显示，总RNA的28S、18S、5S三处条带清晰可见。用核酸蛋白紫外分析仪对其检测，发现样品的OD260/OD280值为1.8，与理论值相符合，表明所提取的总RNA样品质量优质，有良好的完整性(图1)。

1.DL 2 000 Marker; 2.阴性对照; 3.总RNA1.DL 2 000 Marke; 2.Negative control; 3.The total RNA

2.2 扩增目的基因

Oligo(dT)15为引物，扩增鸡免疫器官总RNA，反转录为cDNA。以此cDNA 为模板，进行目的基因p53、β-actin扩增，对反应条件进行优化，所扩增产物电泳结果如图2、图3，目的条带清晰。经过测序，并与p53、β-actin于GenBank已发表序列相关序列进行比对，符合相关要求，可以用于之后的试验。

1.DNA Marker DL 2 000; 2.p53 RNA; 3.阴性对照1.DNA Marker DL 2 000; 2.p 53 RNA; 3.Negative control

1.DNA Marker DL 2 000; 2.β-actin RNA; 3.阴性对照1.DNA Marker DL 2 000; 2.β-actin RNA; 3.Negative control

2.3 制备标准曲线

利用程序软件绘制标准曲线，p53以及β-actin的重组阳性质粒作为标准品，把重组阳性质粒做10倍稀释，荧光定量PCR仪进行扩增，根据所得的结果，选择适合浓度的阳性质粒作为标准品，制作标准曲线，所得结果见图4与图5。

图4 p53标准曲线图

图5 β-actin标准曲线图

2.4 相关特异性分析

通过反应，重组阳性质粒p53、β-actin的标准品熔解曲线呈现单峰，峰值分别是90℃、82℃左右(图6、图7)，阴性对照品曲线平直，无杂峰出现，说明只有单一扩增产物，而且引物有良好特异性。

图6 p53熔解曲线

图7 β-actin熔解曲线

2.5 IBDV感染SPF雏鸡免疫器官中p53 mRNA表达的变化

IBDV感染SPF雏鸡，其胸腺和脾脏p53 mRNA表达在病毒感染后3 d极显著(P<0.01)高于相应对照雏鸡，胸腺与脾脏p53 mRNA表达量虽然分别在病毒感染后1 d与5～28 d低于相应对照雏鸡，但未见统计学差异(P>0.05)；法氏囊p53 mRNA在病毒感染后5～7 d不同程度高于相应对照雏鸡(P<0.05)，其他检测点病毒感染雏鸡虽有不同程度的降低，但与对照雏鸡相比统计学差异不显著(P>0.05)(表2)。

3 讨论

当机体发生细胞损伤时，p53基因通过多种途径进行调控，修复损伤DNA[8]。如修复失败后，p53基因还能促进细胞凋亡，抑制肿瘤发生[9]。检测p53基因的研究主要集中在肿瘤性疾病，由于p53基因突变类型较多，突变的位点多，研究的方法种类也很多[10]。各种检测方法，各有所长，具体应用何方法可以根据研究内容决定。实时荧光定量PCR方法灵敏度高、重复性好、特异性强，已应用于多种研究领域[11]。杜先平[12]等用荧光定量方法检测了人结肠癌患者p53基因表达水平，结果显示，实时荧光定量PCR方法检测p53敏感性和特异性都很高。

吕瀛娟等应用SYBR GREENⅠRT-PCR检测大鼠外伤性视神经损伤动物模型p53 mRNA表达变化规律，结果显示，此方法有扩增效率高、特异性强、灵敏度高、Ct值线性范围广、可重复性好的特点[13]。吕晓萍等[14]利用SYBR GREEN I Real-time PCR方法检测了鸡体内IL-2 mRNA的表达情况，检测的方法灵敏、重复性良好，获得了良好的检测结果。隋欣等也建立了实时荧光定量PCR方法检测鸡体内MUC2的表达，结果准确[15]。通过以上研究，可以看出实时荧光定量PCR方法在鸡上应用检测良好。本试验基于已有的研究结果，建立了鸡p53 mRNA绝对定量检测的双标准曲线Real-time PCR方法，此方法以β-actin作为参照物，通过Ct以及相应的标准曲线，对所得数据进行归一化处理[16]，可以算出p53的表达量。通过本试验，可以看出此种检测方法的特异性良好，熔解曲线单一，未见二聚体和非特异性产物。制作标准曲线过程中对重组质粒的各稀释度进行相关检测，试验的重复性良好，而且有较高的灵敏度。