乙肝HBsAg酶联免疫吸附试验检测信号灰区与血清免疫逃逸变异HBsAg的关系研究

薛方 李鹂

(1.陕西省第四人民医院检验科，陕西 西安 710043；2.陕西省疾病预防控制中心计划免疫所(疫苗临床评价中心)，陕西 西安 710054)

乙型肝炎病毒作为临床常见的病毒类型，具备较强的传染性，且属于脱氧核糖核酸病毒，隶属嗜肝脱氧核糖核酸病毒科[1]。一旦感染后，可直接影响患者日常生活以及身体健康，若未能够尽早发现并及时提供科学疗法，随着疾病持续发展且不断加重，部分患者可进展成为肝硬化或者肝癌，直接危及生命安全[2-3]。有报道指出[4]，乙型肝炎病毒患者的外周静脉血中可测出乙型肝炎病毒DNA、特异性抗体以及抗原等，但部分患者在实施酶联免疫吸附试验(ELISA)时，其中HBsAg检测信号可能位于灰区，直接影响检验结果[5-6]。本文探究乙肝HBsAg ELISA检测信号灰区与血清免疫逃逸变异HBsAg的关系，现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择我院2018年8月至2020年8月纳入的100例乙型肝炎病毒患者，其中男54例，女46例；年龄36～70岁，平均年龄(52.38±1.24)岁；初中至以下36例，高中38例，大专至以上26例；体质量50～74 kg，平均体质量(63.48±1.02)kg；身高157～180 cm，平均身高(170.59±1.45)cm。纳入标准[7]：患者与家属知情同意，经本医院伦理委员会批准通过；符合疾病诊断标准，均存在食欲不振、营养不良、腹部不适、面色晦暗、消瘦等症状；ELISA中显示乙肝HBsAg检测信号处在灰区。排除标准[8]：存在免疫系统缺陷或者疾病者；存在精神方面疾病或者沟通、听力障碍者；合并肝炎史、严重心脑血管疾病者；生化指标水平波动较大者。

1.2方法 收集并整理所有患者的病历资料，分别利用市售ELISA试剂盒以及G6-ELISA试剂测定患者的血清免疫逃逸变异HBsAg。选择乙型肝炎病毒HBsAg检验试剂盒(上海科华生物工程股份有限公司)，利用ELISA法测定信号灰区的患者血清HBsAg，并严格遵照说明书要求进行。市售ELISA检查结束后再次进行G6-ELISA检验，选择单克隆抗体(mAb)与pH9.6的碳酸缓冲液稀释，将稀释后的G6-mAb缓冲液缓慢加入酶标反应板上的各个孔内，剂量均保持在85uL左右，最后置于4℃条件下12 h。随后将G6-mAb样本置于非离子表面活性剂的磷酸缓冲液，重复洗涤，单次洗涤时间控制在60 s左右，放入2%牛血清白蛋白，每孔剂量85uL，置于37℃条件下封闭2 h左右。清除稀释液中封闭液，加入不同稀释浓度的血清样本，酶标反应孔剂量50uL，置于37℃条件下孵育30 min。常规洗板，加入羊抗HBS-HRP(50uL)，以上述同样的条件进行孵育。再次洗板并孵育，加入TMB-H2O溶液，使其显色，时间10 min左右，随后选择硫酸溶液(2 mol/L)停止反应，将其放在酶标仪上，测定450 nm波长位置的吸光度，若P/C≥2.1判定成阳性。

1.3观察指标 对比两组血清免疫逃逸变异HBsAg阳性率以及P/C数据，分析乙肝HBsAg ELISA检测信号灰区与血清免疫逃逸变异HBsAg的关系。其中超临界：P/C水平处于2.6～5.0范围；亚临界：P/C水平处于1.2～1.8范围；临界：P/C水平处于1.9～2.5范围。阳性率是超临界率+亚临界率+临界率之和[9]。

2 结 果

2.1两组血清免疫逃逸变异HBsAg阳性率的对比 市售ELISA组的阳性率明显低于G6-ELISA组(χ2=5.357，P<0.05)。见表1。

表1 两组血清免疫逃逸变异HBsAg阳性率的对比[n(%)，n=100]

2.2两组P/C数据的对比 市售ELISA组的超临界、亚临界、临界、总P/C水平均低于G6-ELISA组(P<0.05)。见表2。

表2 两组P/C数据的对比

3 讨 论

目前，乙型肝炎病毒已经成为全球范围内严重的公共卫生问题，虽然乙肝疫苗能够有效控制疾病的患病率以及传播范围，但近几年乙型肝炎病毒的危险因素不断增多，尤其是生活水平的提升，饮食以及生活习惯发生极大改变，加上工作与生活压力导致免疫能力降低，直接提升乙型肝炎病毒的患病率[10-11]。若未能够尽早发现并及时选择相关干预，可能增加失代偿性肝硬化、肝细胞癌等严重并发症，给患者带来严重后果[12]。因此选择有效检验方式成为关键。

HBsAg检查是乙型肝炎病毒中最为多见的诊断方式。以往研究发现，乙肝HBsAg ELISA检测信号灰区的产生可能与自身免疫物质缺少、检验标本或者试剂污染、食物抗体、血清中某因子过量以及检验操作的规范性等因素存在密切相关性[13-14]。但关于乙肝HBsAg ELISA检测信号灰区与血清免疫逃逸变异HBsAg关系尚未统一。本文结果显示，市售ELISA组的阳性率明显低于G6-ELISA组(P<0.05)。市售ELISA组的超临界、亚临界、临界、总P/C水平均低于G6-ELISA组(P<0.05)，提示乙肝HBsAg ELISA法信号灰区患者在排除外界因素干扰的情况下，可明确成乙型肝炎病毒感染，而G6-ELISA法针对血清免疫逃逸变异HBsAg的敏感性较高。经分析发现，目前我国市售的ELISA试剂均选择单克隆抗体，且主要针对HBsAg a决定簇，或者与空间结果存在关联性的抗原定位点，进而使抗原性飘移对表达抗原、检测试剂中抗体的结合能力造成一定影响，最终导致检验结果出现偏差[15]。除此之外，虽然同一抗体在血清免疫逃逸变异HBsAg可发挥免疫反应，但其亲和力较低，也可造成乙肝HBsAg ELISA检测信号灰区产生。

综上所述，乙肝HBsAg ELISA检测信号灰区通常是由血清免疫逃逸变异HBsAg造成，需有效提升其检验能力，保障后续疾病诊断结果的准确性。