中华管鞭虾中虾青素的肠吸收特性研究

贾 喆，许 艳，刘欣妍，张肖瑕，宋 茹

（浙江海洋大学食品与药学学院，浙江 舟山 316022）

虾青素，又称虾黄素、虾黄质，化学名称为3，3’-二羟基-4，4’-二酮基-β，β’-胡萝卜素，分子式为C40H52O4，相对分子质量为596.86，是一种橙红色酮式类胡萝卜素，其化学结构通过共轭双键形式衔接4 个异戊二烯单元，同时两端有2 个异戊二烯单元构成的六元环［1，2］。虾青素分子2 个六元环上的羟基能够与脂肪酸结合形成虾青素脂肪酸酯，根据结合脂肪酸数量的不同，又可以分为虾青素单酯和虾青素双酯，天然虾青素多数以酯的形态存在［3］。虾青素不溶于水，但能溶于大多数有机溶剂，其抗氧化性是β-胡萝卜素和叶黄素的10 倍，是天然维生素E的100 倍。研究还发现虾青素有抗肿瘤、调节免疫、抗炎等作用，因此在食品、医药等领域有着广泛的应用前景［4］。

中华管鞭虾（Solenocera crassicornis）俗名红虾，是一年生底栖甲壳动物，外壳较薄并且光滑，呈粉红色，广泛分布于中国黄海南部及印度尼西亚、日本、印度等国家的海域［5］。中华管鞭虾味甜鲜美、营养丰富，是中国重要的海捕虾之一。目前，中国对水产加工过程中产生的虾下脚料利用率较低，其中30%～50%的虾下脚料中包括虾头、虾壳等，基本的处理方法是加工成附加值不高的水产饲料。本研究以中华管鞭虾的虾壳为原料，对虾青素进行提取和皂化，通过对Sprague Dawley 大鼠进行单次大剂量灌胃，研究0～12 h 肠道内虾青素的保留情况及吸收特性，旨在为中华管鞭虾的虾青素综合利用及作为功能因子在食品中的应用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与仪器

主要材料与试剂：中华管鞭虾，购于舟山市定海区华润万家超市；无水乙醇及其他分析纯试剂，购于上海国药集团；二氯甲烷、甲醇、乙腈、甲基叔丁基醚为色谱纯，购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司；虾青素标准品（纯度>99%），购于德国Dr.Ehrenstor⁃fer公司。

主要仪器与设备：LC-LX-HR165A 离心机，北京力辰科技有限公司；Agilent 1260 Infinity 高效液相色谱仪，德国安捷伦科技有限公司。

1.2 试验动物

Sprague Dawley（SD）雄性大鼠，5 周龄，体质量约180～200 g，购于杭州子源实验动物科技有限公司，浙江省实验动物质量合格证（1911100056 号）。

1.3 试验方法

1.3.1 虾青素的提取与皂化 虾青素提取参考Song 等［6］方法并适当修改，具体如下：新鲜中华管鞭虾取壳、破碎，按照1∶5 比例加入无水乙醇，37 ℃水浴振荡提取1 h，然后在6 000 r/min 条件下离心10 min，收集上清液，沉淀重复提取2 次，合并上清液，旋转蒸发浓缩，按1∶2 比例加入石油醚萃取3 次，收集石油醚层，经旋转蒸发浓缩后，避光冷冻干燥24 h，充氮气，-20 ℃保藏备用。

皂化方法参考Su 等［7］的方法并适当修改，具体如下：虾青素提取物用无水乙醇复溶，按4∶1 比例加入0.105 mol/L 氢氧化钠-甲醇溶液，5 ℃水浴下皂化2 h，按1∶2.5 加入去离子水终止反应。石油醚萃取皂化液3 次至基本无色，合并石油醚层，经旋转蒸发浓缩后，避光冷冻干燥24 h，即为皂化虾青素，充氮气，-20 ℃保藏备用。

1.3.2 虾青素肠吸收 将大鼠随机分为空白组、皂化虾青素组和未皂化虾青素组，每组12 只，其中皂化与未皂化虾青素组分别灌胃0.5 mL 皂化虾青素、未皂化虾青素（均用玉米油溶解至质量浓度60 mg/mL），空白组灌胃等体积玉米油。在灌胃6 h和12 h 后，每组随机抽取6 只大鼠，脱颈处死，从空肠、回肠、结肠分别刮取肠道内容物，按照1∶1.5 加入无水乙醇，漩涡震荡2 min 后提取肠道内容物中虾青素，5 000 r/min条件下离心15 min，上清液用0.22 μm滤膜过滤，备用。

1.3.3 总虾青素含量测定 参考Xu 等［8］高效液相色谱法测定总虾青素含量：采用C18色谱柱（4.6 μm×250 mm），进样量10 μL，柱温25 ℃，流动相A 为甲醇，流动相B 为甲基叔丁基醚，用90%流动相A 和10%流动相B 组成混合洗脱剂洗脱15 min，检测波长477 nm。虾青素标准品（1～40 μg/mL）在同样条件下洗脱，根据虾青素标准曲线y=23.773x+3.687 5（R2=0.998 5）（其中x为虾青素浓度；y为波长477 nm下吸光值）计算样品虾青素含量（μg/g）。

式中，C为样品中虾青素浓度（μg/mL）；V为提取液体积（mL）；m为肠道内容物质量（g）。

1.3.4 游离型和酯型虾青素含量测定 参考Yuan等［9］的方法，具体如下：采用C18色谱柱（4.6 μm×250mm），进样量10 μL，柱温25 ℃，流动相A 为二氯甲烷∶甲醇∶乙腈∶水=5∶85∶5.5∶4.5，流动相B 为二氯甲烷∶甲醇∶乙腈∶水=22∶28∶45.5∶4.5。洗脱条件为：0～10 min 用100% 流 动 相A 洗 脱；10～20 min 用0～100%流动相B 梯度洗脱；20～35 min 用100%流动相B 洗脱，35～45 min 用0～100%流动相B 梯度洗脱，流速为1.0 mL/min，检测波长为477 nm。

虾青素标准品（40 μg/mL）在上述条件下洗脱，提取物中游离型与酯型虾青素相对浓度按照式（2）计算，再根据公式（1）计算样品虾青素含量。

式中，C为游离型、酯型虾青素相对浓度（μg/mL）；S为游离型或酯型虾青素总峰面积（mAU·s）；S标准为虾青素标准品总峰面积（mAU·s）；C标准为虾青素标准品浓度（μg/mL）。

1.4 数据统计分析

本试验数据使用Origin 2018 软件绘制图形，结果以平均值±标准差（n=3）表示。采用SPSS 19.0 软件对组间数据差异性进行分析，P<0.05 表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 灌胃不同时间小肠不同部位虾青素分布及含量比较

大鼠经皂化与未皂化虾青素灌胃6 h 和12 h 后，虾青素在小肠不同部位的分布及虾青素含量比较如图1 所示。由图1A、图1B 和图1C 可知，大鼠经皂化、未皂化虾青素灌胃6 h 后，空肠、回肠、结肠内容物中均未检测出虾青素。灌胃12 h 后，仅在结肠内容物中检测出皂化与未皂化虾青素，其中皂化组结肠内容物中虾青素含量为（283.221±89.50）μg/g，显著高于未皂化组的（126.850±40.49）μg/g（P<0.05）（图1D）。未皂化和皂化中华管鞭虾虾青素灌胃大鼠6 h 后，虾青素经过大鼠小肠（十二指肠、空肠、回肠）的过程中可能已有部分被吸收，所以各肠段内容物中未检测出虾青素，但是灌胃12 h 后无论是皂化组还是未皂化组均在大鼠结肠内容物中检测到虾青素，表明大部分虾青素在结肠处累积。周庆新等［10］研究发现，雨生红球藻源虾青素酯在十二指肠、空肠、回肠中均有吸收，且以空肠为主，说明不同来源的虾青素因其结构组成不同，吸收特性也存在差异。

图1 小肠不同部位虾青素分布及含量比较

天然虾青素主要以游离型和酯型2 种形式存在，自然界中游离型虾青素含量较少，酯型虾青素根据虾青素分子中的羟基与脂肪酸反应又可以分为虾青素单酯和虾青素双酯。但是，不同来源的虾青素其游离型与酯型比例有所不同［11］。中华管鞭虾虾青素主要以酯型虾青素为主，碱皂化可以显著提高游离型虾青素含量［12］。类胡萝卜素在动物胃肠道消化酶的作用下，从其蛋白结合物中分离出来，在十二指肠中与其他脂类物质一起经胆汁乳化后形成微团（乳糜微粒），自由扩散到肠壁表面，然后由肠黏膜细胞吸收［13，14］。由图1D 可知，结肠中未皂化虾青素含量显著低于皂化虾青素含量，可能由于未皂化虾青素中含有大量酯型虾青素，更易溶于某些脂类物质，因此可直接经胆汁乳化形成乳糜微粒被肠道吸收，从而造成未皂化虾青素的初期肠吸收速率高于皂化虾青素。

2.2 粪便中虾青素含量

为了进一步研究皂化与未皂化虾青素在大鼠结肠累积后的吸收特性，大鼠经皂化和未皂化虾青素连续灌胃14 d，并在最后一次灌胃后收集新鲜排出粪便，提取粪便中总虾青素，采用高效液相色谱法分析粪便中虾青素分布，结果见图2 所示。皂化和未皂化虾青素溶剂为玉米油，其中含有一定量类胡萝卜素，空白组（图2B）在波长477 nm 下出现的色谱峰可能与玉米油本身存在一定量类胡萝卜素有关。通过比较虾青素标准品（图1A）和空白组（图2B）的液相色谱图，可以看出虾青素标准品（全反式）在洗脱时间4.8 min 左右有虾青素特征吸收峰，样品组出现2 个峰，峰1 对应标准品确定为反式虾青素，峰2 推测为9-顺式虾青素。由图2C 和图2D 可以看出，大鼠灌胃虾青素14 d 后，新排出的粪便中可检出少量虾青素，但是皂化组与未皂化组虾青素含量仍存在明显差异性，表现为皂化组虾青素色谱峰面积低于未皂化组，说明皂化组虾青素在结肠中能够进一步被吸收，因此在粪便中残留少。

图2 连续灌胃14 d 大鼠粪便中虾青素分布

由图3 可知，大鼠新排出粪便中皂化与未皂化虾青素组的虾青素总量分别为（11.88±1.39）μg/g 和（57.64±0.51）μg/g，皂化组粪便中虾青素总量显著低于未皂化组（P<0.05），皂化与未皂化虾青素组在结肠中的吸收率分别为95.81%和54.56%，同样差异显著（P<0.05），说明中华管鞭虾的虾青素提取物经过皂化后在结肠中吸收效果要好于未皂化的虾青素提取物，这与Østerlie 等［15］和Coral 等［16］报道游离态虾青素可被人体直接吸收利用，而酯化态虾青素需要在消化道内先被水解成游离虾青素，然后再以游离态形式被人体吸收的研究结果一致。

图3 连续灌胃14 d 大鼠粪便虾青素总量及结肠中虾青素吸收率比较

2.3 粪便中游离型与酯型虾青素分布及含量比较

酯型虾青素的疏水性强于游离型虾青素，而双酯虾青素的疏水性又强于单酯虾青素，因此游离型和酯型虾青素在C18柱洗脱下来顺序依次是游离型虾青素、虾青素单酯和虾青素双酯［17］。由图4 可知，受玉米油影响，空白组存在类胡萝卜素杂峰，且位于酯型虾青素洗脱峰区域。排除空白组杂峰可以发现，皂化虾青素组大鼠粪便仅存在少量游离型虾青素，而未皂化组大鼠粪便中不仅存在少量酯型虾青素，还存在游离型虾青素，而且游离型虾青素峰面积明显高于皂化组。

图4 连续灌胃14 d 大鼠粪便游离型与酯型虾青素分布比较

由图5 可知，皂化虾青素组大鼠粪便中游离型虾青素含量为（11.12±0.36）μg/g，未皂化虾青素组大鼠粪便中游离和酯型虾青素含量分别为（21.78±3.40）μg/g 和（7.69±0.32）μg/g，相 对 含 量 分 别 为73.91%和26.09%。周庆新等［10］用雨生红球藻源虾青素酯灌胃动物24 h 后，检测到粪便中虾青素单酯和双酯的相对含量分别为49.76%和4.46%，合计为54.22%，游离型虾青素相对含量为45.78%。本研究未皂化虾青素组大鼠粪便中酯型虾青素相对含量只有26.09%，低于文献报道的54.22%，可能是因为不同来源的虾青素酯消化吸收率不同，也可能与未皂化虾青素中酯型虾青素在结肠微生物发酵作用下转化生成大量游离型虾青素有关，因此，中华管鞭虾的未皂化虾青素在结肠中吸收和转化机制有待进一步研究。

图5 连续灌胃14 d 大鼠粪便中游离型与酯型虾青素含量比较

3 小结

中华管鞭虾皂化和未皂化的虾青素提取物在大鼠小肠内吸收特性不同，灌胃12 h 后在大鼠结肠内容物中检测到未皂化和皂化虾青素，但是其虾青素含量存在显著性差异。经过14 d 连续灌胃，通过比较大鼠新鲜粪便中虾青素总量、游离型和酯型虾青素分布及虾青素含量，发现来源于中华管鞭虾的皂化虾青素提取物较未皂化虾青素提取物具有更好的肠吸收性。因此，经皂化的中华管鞭虾的虾青素提取物具有更广的应用前景。