三种海螵蛸的处理方法及抗菌活性研究❋

朱文静， 陈四清， 谢国驷， 李 杰， 田 蕊， 刘宇岩， 边 力， 胡文革❋❋

(1. 石河子大学生命科学学院， 新疆 石河子 832000； 2. 中国水产科学研究院黄海水产研究所，青岛海洋科学与技术试点国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室， 山东 青岛 266071)

抗生素的滥用使得耐药菌株越来越多，多种药物对耐药菌的疗效减弱，甚至出现“超级细菌”[1]，在耐药菌株大量产生的背景下，中药却因靶点多、来源广等特点未出现明显耐药性[2]，所以近年来研究人员对大量中草药进行了筛选提取，以找出更多的抗菌物质。陈勇川等[3]研究黄芩苷/黄芩素对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌抗药性时，发现黄芩素可显著逆转耐药菌对苯唑西林的高度耐药；胡欢等[4]对卷柏、夏枯草等36种中药材乙醇提取物体外抗菌活性发现有15种草药有广谱抗菌性；张永刚等[5]研究18种中草药对哈维氏弧菌抑菌活性发现仅两种中草药无抑菌性；戴碧鑫等[6]对大黄原药材和药渣进行抗菌试验发现其简单水提液即有抗菌性。中草药是中国传统医药精华，对其进行抗菌活性筛选有广阔的开发前景。

海螵蛸为传统中药，又名乌贼骨，《中医药典》[7]把乌贼科无针乌贼(Sepiellamaindroni)或金乌贼(Sepiaesculenta)的干燥内壳收录为海螵蛸。海螵蛸含碳酸钙、微量元素、氨基酸、壳聚糖等多种成分，其性咸，温，具有生肌止血，制酸止痛，解毒消炎等功效[8-11]。近年来，学者们运用分离成分等现代方法对海螵蛸的药理作用和临床应用进行研究，证实其具有中和胃酸[12]、抗溃疡[13]、成骨[14]、止血[15]等作用。虽然海螵蛸药用范围较广，但在海产品加工中，常作为废料处理，甚至在药用过程中还要去掉硬壳层，造成了海螵蛸资源的严重浪费。

目前，对海螵蛸的研究较少，且多集中在临床治疗溃疡、止血、成骨及其各种成分应用等，尚未有关于其抗菌活性的研究。本研究对金乌贼海螵蛸的简单水溶物进行抗菌试验，待确定其具有抗菌活性后，研究几种处理对抗菌活性的影响，最后探究金乌贼、曼氏无针乌贼和虎斑乌贼(Sepiapharaonis)三种乌贼海螵蛸对几种人体和海洋常见致病菌的抗菌性及差异。本研究旨在丰富抗菌中药材，为海螵蛸抗菌性的开发利用提供依据，避免海螵蛸资源浪费。

1 材料与方法

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 供试药材 金乌贼、曼氏无针乌贼、虎斑乌贼分别采自于山东、福建、广东沿海，解剖出内骨后，用软毛刷轻刷表面脏污墨迹等，用蒸馏水冲干后自然晾干。

1.1.2 供试菌株 试验用菌包括：金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、哈氏弧菌(Vibrioharveyi)、副溶血弧菌(Vibrioparahaemolyticus)、大肠杆菌(Escherichiacoli)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、白色念珠菌(Candidaalbicans)，其中前五株由中国水产科学研究院黄海水产研究所病研室提供，后三株为标准菌株。

1.1.3 试剂 2216E琼脂、2216E液体培养基、Mueller-Hinton琼脂、沙氏葡萄糖肉汤均购自青岛高科技工业园海博生物技术有限公司，牛肉膏蛋白胨肉汤购自索莱宝科技有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 原材料处理 三种海螵蛸经粉碎过50目筛，在烘箱低温(60 ℃)烘干至恒重，装于50 mL离心管放干燥器中保存备用。

1.2.2 药液原液制备 预实验中发现金乌贼海螵蛸对金黄色葡萄球菌抑制效果明显，因此通过选用金乌贼海螵蛸不同处理方法药液对金黄色葡萄球菌的抗菌性的比较，研究确定三种海螵蛸的药液原液制备方法，具体方法如下(每种方法重复3个平板)：

步骤A：海螵蛸粉末的初步处理(见表1)。

表1 金乌贼海螵蛸处理方法Table 1 Treatment of cuttlebone

步骤B：海螵蛸的溶剂选择：称取海螵蛸2 g，分别加灭菌蒸馏水、灭菌0.9% NaCl 溶液、60%乙醇、80%乙醇、无水乙醇至10 mL，用A确定的最佳方法处理后检测抗菌效果，选择抗菌效果最好的溶剂作为最佳溶剂。

步骤C：海螵蛸固液比的确定：分别称取5.00、3.35、2.50、2.00、1.65 g海螵蛸粉末于离心管，补足B确定的最佳溶剂至10 mL，用A确定的最佳方法处理后检测抗菌效果，得到最佳固液比。

步骤D：海螵蛸粉末的浸泡时间：用A确定的最佳方法处理、B确定的最佳溶剂、C确定的最适固液比分别在实验4、6、8、12、24、36 h检测抗菌效果。

确定好最佳处理方法后，分别称取三种海螵蛸粉末20 g，按上述筛选的最佳方法处理后，用旋蒸仪在60 ℃以下减压浓缩成1 g/mL的浸液，经过0.22 μm滤膜滤过后放在抗生素药敏瓶中备用。

1.2.3 药敏纸片制备 用打孔器对干净且吸水性较强的优质定性滤纸打孔成6 mm 的圆形的滤纸片，并置于洁净干燥的玻璃培养皿中，在 121 ℃的条件下高压蒸汽灭菌30 min，灭菌后置于生物安全柜内备用。实验开始时，每个滤纸片加10 μL 1 g/mL的浸液。

1.2.4 微生物培养活化及菌悬液制备 制备牛肉膏蛋白质肉汤、沙氏肉汤、2216E液体培养基、2216E琼脂和Mueller-Hinton琼脂，121 ℃灭菌15 min，琼脂冷却后在无菌环境倒入培养皿。在生物安全柜内，将供试菌株用接种环接种在其对应的液体培养基内，28℃摇床恒温培养18 h，用0.5号麦氏比浊管确定菌液浓度后稀释至107～108CFU/mL 备后续的药敏纸片抑菌实验用，105～106CFU/mL备后续的最小抑菌浓度使用。

1.2.5 海螵蛸对受试菌株的抑菌作用 在生物安全柜中，每个平板加100 μL 细菌肉汤(每个菌种都接种于Mueller-Hinton平板，溶藻弧菌和哈氏弧菌另接入2216E固体平板)，用涂布棒涂板后放上加药液的滤纸片，设置四环素药敏片作阳性对照组，阳性对照试验一次，三种海螵蛸药液在每种平板上均重复3次测定。

将处理好的细菌平板于 28 ℃培养箱培养 24 h，到培养时间结束后取出，观察菌落的生长情况，采用十字交叉方法测量抑菌圈的直径，记录数据，每组重复3次，取平均值，抑菌圈直径>20 mm为极敏，直径在15～20 mm之间为高敏；直径在10～14 mm之间为中敏；直径<10 mm为低敏；直径<8 mm为无抗菌性[16-18]。最后计算的平均值转换为抑菌率评价抑菌效果。实验中将抑菌率作为评价抗菌效果的指标，抑菌率的计算公式如下：

1.2.6 最小抑菌浓度测定 采用二倍稀释法测定MIC(Minimum inhibitory concentration)，均按照CLSI 2012版指南进行[19](细菌用MH肉汤培养液，真菌用液体沙氏培养基)。按无菌操作吸取药液和菌悬液各100 μL于96孔板第1孔至第11孔中，第12孔加入配制溶剂和菌悬液各100 μL作为阴性对照。96孔板置于恒温培养箱中28 ℃培养24 h，吸取每个不同浓度梯度的药液接种于普通培养基上，每种药物3个重复，置于28 ℃恒温培养箱中培养24 h。肉眼观察药物最低浓度无细菌生长，即为该药的MIC。

1.3 数据处理与分析

处理方法所得结果用Excel进行平均值计算并作图；药敏结果采用SPSS 22.0统计学软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，用均数±标准差(x±s) 表示。

2 结果与分析

2.1 海螵蛸的处理方法

2.1.1 灭菌方法 据表1不同方法灭菌处理的金乌贼海螵蛸粉末药液抑菌效果见表2。

表2 海螵蛸灭菌方法对抑菌活性的影响Table 2 Effect of cuttlebone sterilization on antibacterial activity

从表2可知，A0虽有抑菌效果，但药敏纸片周围有一圈红色菌落，A1、A2、A3无抑菌效果，A4、A5有效果，A5效果最好。A0粉末未灭菌，自身可能带有未知菌，因此药敏纸片周围会有一圈菌。

2.1.2 溶剂种类 据1.2.2步骤B不同溶剂处理的金乌贼海螵蛸粉末药液抑菌效果见表3。

表3 溶剂对抑菌效果的影响Table 3 Effect of solvent on antibacterial activity

表3抗菌圈大小结果显示，五种溶剂对海螵蛸药液抗菌效果的影响是80%乙醇>60%乙醇>无水乙醇>蒸馏水=0.9% NaCl 溶液，80%乙醇处理效果最好。

2.1.3 固液比 据1.2.2步骤C不同固液比处理的金乌贼海螵蛸粉末药液抑菌效果见图1。

图1 固液比对抑菌活性的影响Fig.1 Effect of solid-liquid ratio on antibacterial activity

从图1可以看出，随海螵蛸粉末比例的降低，药液抗菌效果先上升后下降，固液比1∶4时抗菌效果最好。

2.1.4 浸泡时间 据1.2.2步骤D不同时间处理的金乌贼海螵蛸粉末药液抑菌效果见图2。

图2 时间对抑菌活性的影响Fig.2 Effect of time on bacteriostatic activity

从图2可知，随浸泡时间的延长，海螵蛸药液抗菌效果先快速增强，在6 h时达到最大，随着浸泡时间的增长，药液抗菌效果逐渐下降。

2.2 海螵蛸对受试菌株的抑菌作用

称三种海螵蛸粉末各20 g，依据上述实验结果，按固液比1∶4加入80%酒精于锥形瓶中， 80 W超声波3次，60 ℃，每次20 min，震荡混合6 h，用旋蒸仪在60 ℃以下减压浓缩去酒精成1 g/mL的浸液，0.22 μm滤膜过滤。为防止酒精残留的影响，增加一个80%酒精对照组，100 mL 80%酒精同样在旋蒸仪旋蒸。在涂布过菌的平板上加上滤纸片，每个滤纸片加10 μL药液，每种菌重复3个板，结果见表4。

表4 三种海螵蛸对8株受试菌的抑菌效果Table 4 Inhibition zones of three cuttlebone against 8 tested strains

由表4可知，三种海螵蛸对铜绿假单胞菌、副溶血弧菌和白色念珠菌均无抑制作用；对金黄色葡萄球菌、溶藻弧菌和哈氏弧菌均有抑制作用，以金乌贼海螵蛸抑制哈氏弧菌效果最好，抑菌圈、抑菌率最大(12.23 mm、103%)；金乌贼和曼氏无针乌贼对枯草芽孢杆菌、大肠杆菌有抑制作用，虎斑乌贼无抑制作用。

2.3 最小抑菌浓度

测定最小抑菌浓度时，为了防止酒精残留对菌的影响，同时设置同条件处理的80%酒精对照管。根据表4结果，选取抑菌率>50%的菌种进行最小抑菌浓度的测定，测定结果如表5所示。

表5结果显示，金乌贼海螵蛸和曼氏无针乌贼对枯草芽孢杆菌MIC>125 mg/mL，抑制效果较弱，虎斑乌贼无抑制效果；对金黄色葡萄球菌金乌贼海螵蛸和曼氏无针乌贼MIC为31.25 mg/mL，有一定抑制效果，虎斑乌贼MIC>125 mg/mL，抑制较弱；对海洋常见的菌哈氏弧菌和溶藻弧菌金乌贼、曼氏无针乌贼MIC分别为3.9、15.6 mg/mL，虎斑乌贼分别为15.6、31.25 mg/mL，说明金乌贼、曼氏无针乌贼抑制效果好，虎斑乌贼有一定抑制效果。

表5 三种海螵蛸对受试菌的MIC测定Table 5 MIC determination of three cuttlebone against tested strains /(mg·mL-1)

3 讨论

3.1 海螵蛸处理方法的比较

海螵蛸是传统的中药，具有消炎、制酸止痛作用。不同的处理方法会使海螵蛸抗菌活性发生变化，本研究结果表明，中药常用的水煮法获得的海螵蛸粉末水煮液对细菌无效，粉末紫外、高压处理的也无效，可能是因为高温、紫外破坏海螵蛸内对抗菌有效的分子结构。结合范薏淇等[11]综述海螵蛸成分含有壳聚糖，壳聚糖多由天然甲壳类动物外骨骼和藻类中提取，具有广谱抗菌活性[20-22]，超声波处理组药液效果最好，可能原因是壳聚糖不易溶于水，超声波具有灭菌作用，可以帮助部分壳聚糖溶解而不破坏分子结构，因此，用超声波处理加灭菌蒸馏水的海螵蛸粉末获得药液为最佳灭菌方法。

(①金乌贼Sepia esculenta；②曼氏无针乌贼Sepiella maindroni；③虎斑乌贼Sepia pharaonis.)图3 海螵蛸对各种细菌的抑菌圈Fig.3 Inhibition zone of cuttlebone against various bacteria

海螵蛸在治疗溃疡创伤时，民间使用方法多是直接撒于创伤处，但直接用海螵蛸粉末测定抗菌活性不便操作，因此试验采用浸泡提取药液进行。根据汤嘉文[23]论述的中药抗菌机制，并结合李兰等[24]发现的海螵蛸主要成分为碳酸钙，还含有一些其它金属离子，推测海螵蛸的抗菌作用机制可能是破坏细胞结构。因海螵蛸碳酸钙含量高，在80%乙醇溶液中会有部分Ca2+水解出，带正电荷的Ca2+会和带负电的细菌细胞膜产生静电作用，改变和破坏细菌表面膜结构，导致细菌死亡[25]，而有些成分，如氨基酸、多糖脂溶性较好，因此纯水、纯乙醇均没有80%酒精抑菌效果好。付若秋等[26]研究牡丹皮体外抗菌效果发现的水提取物强于乙醇提取物，可能与牡丹皮水溶性的抗菌物质为主有关，胡欢[4]对36种中药抗菌活性研究时所用溶剂与本实验结果相同，说明80%乙醇是海螵蛸的理想提取剂。

唐丽娟等[27]研究海螵蛸多糖的最佳提取条件时，发现固液比对多糖的提取有影响，推测海螵蛸提取液药效也会受到固液比影响，本实验海螵蛸与80%乙醇不同固液比的抗菌效果表明固液比1∶4时抗菌圈直径最大，效果最好，这一结果与唐丽娟的研究结果一致，即固液比影响海螵蛸提取液的药效，固液比1∶4效果最好。

每种中药的浸泡提取时间都有一定要求，依据上述试验结果，金乌贼海螵蛸粉末在不同浸泡时间处理下，4～6 h 药液抗菌圈增大，6 h后药液抗菌圈逐渐减小，浸泡6 h的药液抗菌圈最大。分析原因可能是在6 h前，海螵蛸有效成分未能充分浸泡溶解，6 h左右溶解最好，随着时间延长，溶解的有效成分在溶液中可能发生反应或变化，从而使药效减弱。

3.2 海螵蛸抗菌活性的比较

海螵蛸具有治疗沙眼[28]、溃烂期褥疮[29]的功效，沙眼和溃烂期褥疮会面临感染细菌的危险，而用海螵蛸则可治疗，说明海螵蛸具有抗菌作用，表4中对8株受试菌的抑菌实验药敏性分析显示，对金乌贼和曼氏无针乌贼海螵蛸金黄色葡萄球菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌表现为中敏，枯草芽孢杆菌表现为低敏，大肠杆菌虽然有抑菌圈，但直径较小，表现为不敏感；对虎斑乌贼海螵蛸金黄色葡萄球菌、溶藻弧菌、哈氏弧菌表现为低敏。

实验中，80%酒精对照组菌落生长均不受影响，而加药组菌株生长受到明显抑制，可以排除80%酒精残留的影响，说明利用80%酒精帮助提取海螵蛸药液是可行。实验发现，海螵蛸在2216E培养基上，对哈氏弧菌和溶藻弧菌有抑菌效果，在MH培养基上，几乎无抑菌效果现象，这说明海螵蛸的药效会受到环境因子的影响，具体机制有待进一步研究。

顾青青等[30]对不同产地的海螵蛸核苷类成分测定中发现，不同地区核苷类成分差异较大，这一结果与本研究的三种海螵蛸效果不同有相似之处。顾青青采集的不同产地海螵蛸，来自福建、山东、海南等地，由于没有进行种类鉴定，有可能是不同品种乌贼的海螵蛸，造成成分差异，这也是造成药效差异的一个重要因素。为此推测海螵蛸的药效与种类、产地密切相关。

另外综合比较抑菌圈与MIC发现，金乌贼和曼氏无针乌贼的海螵蛸药液抑菌效果明显强于虎斑乌贼，与《中国药典》中仅把前两种认定为海螵蛸一致。而不把虎斑乌贼列为海螵蛸，除了抗菌效果没有金乌贼和曼氏无针乌贼明显外，其资源不足也是一大原因。董正之[31]曾对中国近海头足类分布状况进行统计，黄海区域占优势的物种是金乌贼、东海区域占优势的物种是曼氏无针乌贼，而虎斑乌贼则主要分布在西北太平洋和北印度洋等热带海域沿海[32-34]。同时，金乌贼作为世界乌贼科中重要的经济种类之一，年产量在世界乌贼科种类中居第二位[35]，其捕捞量远超虎斑乌贼，因而得到的内壳量也多。

综上所述，影响海螵蛸抗菌活性的因素较多，产地、提取方法等都会有影响，而部分中药常有“体外无效，经体内代谢后起效”的现象，体内体外实验也可能会有很大差距，因此后续试验可以尝试进行体内试验。目前对中药抗菌性的应用多联合西药[3,36]，实验发现海螵蛸抗菌效果较抗生素差，正式应用时可与其它药物联合。另外，虽然虎斑乌贼海螵蛸抑菌活性差，但其规格比金乌贼和曼氏无针乌贼大，在南海有较大的产量，因此作为海产品加工中的副产品，也应该进一步研究其药理功能，充分发挥海洋资源作用。