微小RNA对阿霉素诱导心脏毒性保护作用的研究进展

邢策，白锋，余静，孙守刚

阿霉素（DOX）诱导的心脏毒性是一个复杂的病理生理过程，由转录因子调控、氧化应激、内质网应激、线粒体损伤、心肌细胞凋亡和自噬失调共同参与，microRNA（miRNA）在心血管疾病领域中的研究增加，并且趋于成熟。诸多研究结果表明miRNA参与并调节了DOX心脏毒性的病理生理过程。因此，本文对miRNA在DOX心脏毒性中的作用及机制做一综述。

1 miRNA和DOX心脏毒性

1.1 miRNA作用及其机制

microRNA（miRNA）是一种内源性的非编码小分子RNA，长度约为20-24个核苷酸，在细胞的分化、代谢和凋亡中都发挥重要的调控作用。miRNA通过与靶基因mRNA 3′-非翻译区结合，诱导沉默复合物（miRISC）降解或抑制靶基因蛋白翻译，从而负性调节靶基因转录后水平。miRNA负性调控靶基因的表达有2种机制，取决于miRNA与靶mRNA 3′-非翻译区互补的程度。若完全或近乎完全互补可诱发RNA干扰，mRNA被降解；而多数miRNA与靶mRNA并不完全互补，只起到封闭靶mRNA的作用，即抑制翻译过程。miRNA不需要完美的靶标识别互补性，因此单个miRNA负责多个mRNA的调控。尽管miRNA对每个单独的mRNA靶标产生轻微影响，但是组合效应是显著的，并且产生可测量的表型结果。最近的研究表明在DOX治疗后心脏中大量miRNA发生改变，许多miRNA的改变与其他疾病重叠，诸多研究结果表明DOX治疗后特异性心脏miRNA可能参与并调节了DOX心脏毒性的发生、进展过程及病理形成过程，有望指导疾病的预测，诊断和治疗。

1.2 DOX诱导的心脏毒性

DOX属于蒽环类药物，用于治疗多种癌症，例如实体瘤，淋巴瘤和乳腺癌。但是DOX诱导的心脏毒性严重限制其使用，这使很多患者不能接受规范剂量的治疗，甚至需要停药。如何在不影响其抗肿瘤作用的前提下，抑制或减弱其心脏毒性成为研究者努力的方向，DOX诱导心脏毒性的分子机制尚未得到很好的阐明，普遍认为是多因素共同作用的结果，如转录因子调控、氧化应激损伤、内质网应激、线粒体损伤、心肌细胞凋亡和自噬失调等。这些因素之间相互联系、互为因果，形成恶性网络，共同促进心脏毒性的发展。

2 miRNA调控DOX心脏毒性的机制

2.1 DOX心脏毒性模型miRNA表达谱的改变

有研究对DOX处理小鼠血浆及组织提取RNA进行芯片分析，血浆中有表达差异的miRNA共11个，其中上调的7个，包括miR-32-5p、miR-34a-5p、miR-34b-3p、miR-34c-5p、miR-133a-3p、miR-301b-3p、miR-499-5p，下调的4个，包括miR-93-5p、miR-140-3p、miR-431-5p、miR-451a，心脏组织中有表达差异的miRNA7个，miR-34a-5p在心房上调而心室下调，miR-451a在心房和心室中均下调，miR-128-3p和miR-190a-5p仅在心房中上调，miR-484a仅在心房中下调，miR-146a-5p和-351在心室中均被下调，研究表明miR-34a-5p、miR-133a-3p、miR-499-5p与氧化还原诱导的心脏毒性有关，miR-133a-3p和miR-499-5p心脏重塑有关，DOX处理后miR-93-5p减少可能导致心脏毒性的发生和进展，miR-140-3p血浆水平的升高与冠状动脉事件的发生有关，但仅在早期阶段，miR-128与心肌梗死后纤维化和心功能障碍有关，miR-190下调与腹主动脉缩窄诱导的心脏肥大有关，这表明miRNA也可能在氧化还原引发的心脏重塑中发挥作用。

2.2 miRNA与转录因子调控

转录因子可通过调控细胞因子及相关信号通路参与DOX心脏毒性过程，转录因子上游靶基因可能作为DOX心脏毒性的预测性分子标志物。过氧化物酶体增殖物激活受体γ（peroxisome proliferator activated receptorsγ，PPARγ）是一类核转录因子，属于Ⅱ型核受体超家族成员，能被脂肪酸样化合物过氧化物酶体增殖剂激活，激活后可调控多种核内靶基因的表达，PPARγ在细胞代谢、心肌细胞形成和心脏发育中也起着至关重要的作用，Pakravan等人研究发现miR-130a抑制PPARγ的表达，PPARγ对DOX心脏毒性具有保护作用，特异性激活PPARγ通过上调Bcl-2抑制HO诱导心肌细胞的凋亡，抑制miR-130a能够通过增加PPARγ表达来减弱DOX心脏毒性。

GATA结合蛋白锌指转录因子家族中均含有锌指结构，GATA4作为一种重要的心脏相关转录因子，可调节多个心脏基因的表达，包括抗凋亡基因Bcl-2，DOX心脏毒性与GATA4的降低密切相关，Tony等人研究发现DOX通过上调miR-208a表达促进心肌细胞凋亡，而沉默miR-208a可减轻DOX诱导的心肌细胞凋亡并改善心功能，miR-208a是靶向GATA4的心脏特异性miRNA，抑制miR-208a能够通过上调GATA4表达来减轻DOX心脏毒性。转录因子GATA6也属于GATA家族的一员，目前的研究已经证实GATA6在人类心脏分化发育过程中起着至关重要的作用，Alonso等研究发现DOX在心肌细胞中触发miR-30家族下调，过表达miR-30对DOX心脏毒性具有保护作用，GATA-6介导了DOX诱导的miR-30下调，GATA6是一种在心脏中高度表达的转录因子，在心脏发育中起着关键作用，DOX诱导的GATA6上调抑制了miR-30转录，在GATA6沉默时miR-30上调。

2.3 miRNA与氧化应激损伤

miR-34家族成员参与细胞周期、衰老、凋亡、分化以及心脏对应激的反应，miR-34a通常被认为介导了心肌细胞的损伤，miR-34a也是急性心肌梗死后HF发作的血浆生物标志物。近期研究发现miR-34a-5p通过Sirt1/p66shc途径介导了DOX对心肌细胞的促凋亡作用，沉默信息调节因子1（Sirt1）是miR-34a-5p的靶基因，Sirt1是NAD依赖的脱乙酰基酶，介导PGC-1α，FOXO3，p53和NF-κB等靶基因的脱乙酰基化，对线粒体功能，细胞凋亡和组织炎症具有重要的影响，p66Shc是细胞内氧化信号转导的关键介质，通过增加ROS浓度来调节细胞内氧化还原平衡，p66shc通过增加脂质过氧化介导线粒体途径的细胞凋亡，miR-34a-5p参与了DOX诱导的心肌细胞凋亡，并且它也是DOX心脏毒性的潜在生物标志物，DOX诱导心肌细胞中miR-34a-5p的上调是由NF-κB/P53信号通路激活引起的，在H9C2细胞中过表达Sirt1，可抑制miR-34a-5p的表达，miR-34a-5p、Sirt1和p53之间的负反馈环支持了这一结果。

miRNA-22是一种心脏和骨骼肌富集的miR‐NA，在氧化应激引起的心脏损伤中起着关键的调节作用，作用于下游靶基因Sirt1，可下调Sirt1的表达，miRNA-22/Sirt1途径在调节DOX心脏毒性中发挥重要作用，miR-22作用于靶基因Sirt1的3'-非翻译区，可导致Sirt1的下调，存在或不存在DOX的情况下，抑制miR-22可增加Sirt1蛋白和mRNA水平，并引起超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX）等细胞保护酶活性的上调和NADPH氧化酶（NOX）等细胞损伤酶活性的下调，特异性抑制miR-22通过上调Sirt1来介导对氧化应激和心肌细胞凋亡的保护作用。

miR-140-5p通过靶向核因子E2相关因子2（Nrf2）和沉默信息调节因子2（SIRT2）促进心肌氧化应激，在DOX诱导的心脏毒性中起着重要作用，表现为体内ROS、MDA水平增高和SOD、GSH、GSH-Px水平降低，miR-140-5p显著降低Nrf2和SIRT2的表达水平，然后影响I型血红素氧化酶（HO-1）、醌氧化还原酶（NQO1）、谷胱甘肽-S-转移酶（Gst）、谷氨酸半胱氨酸连接酶（GCLM）、Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1（Keap1）和叉头框蛋白O3a（FOXO3a）的表达水平，从而增加DOX引起的心肌氧化损伤，Nrf2和SIRT2是miR-140-5p的下游靶基因，miR-140-5p影响Nrf2和Sirt2信号通路，过表达miR-140-5p明显降低了Nrf2、Sirt2的蛋白水平，加重了DOX在心肌细胞中诱导的氧化损伤。miR-140-5p/Nrf2和miR-140-5p/SIRT2可能被认为是治疗DOX诱导的心脏毒性的新靶点。

miR-200a可 以 靶 向Keap1mRNA，促 进Ke‐ap1mRNA的降解，Keap1是Nrf2泛素化和降解的支架蛋白，在应对氧化应激时，Nrf2从Keap1中释放，并转移到细胞核中，调节抗氧化和解毒基因的表达，Keap1mRNA的降解可导致Nrf2活化，Hu等人研究发现过表达miR-200a减弱DOX诱导的小鼠心肌氧化应激损伤，miR-200a转染的细胞中，Ke‐ap1mRNA水平显著降低，过表达miR-200a显著增加了Nrf2蛋白的表达，miR-200a/Nrf2途径介导了DOX心脏毒性是。另外miR-200a是一种肿瘤抑制剂，表明以miR-200a开发药物治疗可能不会损害DOX的肿瘤疗效。

miR-375在心血管疾病的发病机制中起着重要作用，在心衰的人和小鼠心脏表达增加，抑制心肌miR-375可降低缺血性心脏病的炎症反应，增强心肌细胞存活，在大鼠高血压模型中，抑制miR-375-3p通过促进乳酸脱氢酶B的表达减少AngⅡ诱导的大鼠心肌肥大，Zhang等人研究发现抑制miR-375可降低DOX心脏毒性小鼠模型的氧化损伤，抑制miR-375具有抗氧化损伤的保护作用，该作用在体内和体外被AKT抑制剂消除，抑制miR-375通过靶向PDK1激活AKT信号通路，抑制miR-375通过激活PDK1/AKT信号通路减少DOX诱导的心脏氧化损伤。

2.4 miRNA与线粒体损伤

近期一项研究阐述了miR-23a/PGC-1α信号通路在DOX诱导线粒体损伤中的作用及其机制，DOX引起大鼠心脏细胞线粒体结构和功能损伤，使心肌细胞线粒体膜电位（MMP）去极化和线粒体通透性转换孔（mPTP）开放增加，DOX通过破坏电子呼吸链降低心肌ATP含量，下调过氧化物酶体前增殖物激活受体α（PPARα）、过氧化物酶体增殖物激活受体γ共激活因子1（PGC-1α），线粒体是DOX心肌细胞毒性的主要靶细胞器。DOX诱导线粒体过度分裂，其特征是通过上调线粒体动力相关蛋白-1（Drp1）和/或下调线粒体融合蛋白-2（Mfn2）来促进心肌细胞线粒体依赖性凋亡，PGC-1α参与协调能量代谢并调节线粒体动力学，PGC-1α在DOX诱导的心肌病中受到抑制，DOX通过抑制PGC-1α/Drp1途径诱导心肌细胞凋亡，miR-23a促进了这一过程，从而激活线粒体依赖性凋亡，相反抑制miR-23a可恢复PGC-1α的表达，这一作用可通过抑制Drp1来减少DOX诱导的线粒体功能障碍，维持线粒体稳态。

Caspase富集功能域凋亡抑制因子（ARC）是心脏具有的天然抗凋亡因子，ARC是有丝分裂后细胞的内源性凋亡抑制剂，可以拮抗内源性和外源性凋亡信号通路，ARC在维持心脏生理方面起着重要作用，病理条件下ARC被下调，在许多心脏疾病的发生中起着重要作用，如心脏肥大、心力衰竭和心脏梗死。Wang等研究发现ARC是DOX心脏毒性的关键靶点，ARC能够抑制DOX诱导的心肌细胞线粒体分裂和凋亡，线粒体分裂需要线粒体动力相关蛋白1（Drp1）的活性，ARC可以防止Drp1在线粒体中的积累，ARC可抑制DOX诱导的小鼠心肌细胞线粒体分裂和凋亡，miR-532-3p靶向ARC调控DOX心脏毒性过程中线粒体分裂和凋亡，miR-532-3p抑制ARC的表达介导DOX引起心脏毒性，miR-532-3P/ARC成为保护DOX心脏毒性，调节细胞功能重要途径。

Jing等人研究发现miR-29b（miR-29家族的一个成员）是细胞凋亡线粒体途径的重要调节因子，Bax是激活心肌细胞凋亡和DOX心脏毒性线粒体途径的关键基因，miR-29b通过抑制线粒体依赖性途径减轻DOX诱导的心肌细胞凋亡，研究证实Bax是miR-29b的下游靶基因，miR-29b作用于靶基因Bax 3'-非翻译区，抑制miR-29b明显增强了DOX诱导的线粒体膜电位（MMP）去极化，MMP的去极化诱导细胞色素C从线粒体释放到细胞质，并随后导致cas‐pase级联活化。

生理条件下miR-499-5p在心脏中高水平表达，抑制β-肌球蛋白重链的表达，从而增强心肌氧代谢耐受性，miR-499-5p通过保护心肌细胞免受应激诱导的细胞凋亡而发挥心脏保护作用，miR-499-5p通过靶向CnAα和CnAβ抑制钙调神经磷酸酶介导的线粒体动力相关蛋白1（Drpl）的去磷酸化，从而减少Drp1线粒体聚集，减轻Drp1介导的线粒体分裂，细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1α（CDKN1a）又称为p21，参与了心肌损伤的病理过程，有研究发现miR-499-5p抑制DOX诱导的线粒体过度分裂，p21是miR-499-5p下游靶基因，miR-499-5p通过靶向p21减弱DOX诱导的线粒体分裂及凋亡。

2.5 miRNA与内质网应激

miRNA在调节DOX诱导心肌细胞凋亡的内质网途径中起到重要作用，内质网应激（ERS）途径介导的心肌细胞凋亡是一种新的信号转导途径，内质网是跨膜蛋白及分泌蛋白合成所在的细胞器。内质网稳态失衡时，内质网正确折叠蛋白质功能异常，可能致误折叠蛋白在内质网内异常聚集及内质网应激性蛋白分泌增加，并且识别错误折叠蛋白，并通过蛋白酶体将其降解，上述一系列反应过程即ERS，网腔钙结合蛋白（calu‐menin）是一种位于哺乳动物心肌细胞内质网/肌浆网内属于CREC家族具有多个EF-hand结构的钙离子（Ca）结合蛋白，calumenin在减轻新生大鼠心肌细胞ERS中起着重要作用，有研究发现ERS介导了DOX心脏毒性大鼠心肌细胞凋亡，calumenin对DOX诱导的心肌细胞凋亡具有保护作用，DOX处理H9C2心肌细胞中calumenin的下调可能与miR‐NA378/378*有关。磷酸肌酸钠是一种高效能量物质，可为心肌细胞提供能量，磷酸肌酸钠抑制心肌细胞通透性，保护线粒体减少细胞凋亡，磷酸肌酸钠对阿霉素所致心脏毒性的保护机制与calumen‐in蛋白、miRNA378/378*的ESR有关，磷酸肌酸钠通过减少ERS启动的心肌细胞凋亡来减轻DOX所致的心脏毒性。

2.6 miRNA与自噬

自噬是一种维持细胞内环境稳态的重要的代谢过程，通过溶酶体降解长寿命蛋白及无功能的细胞器，从而为细胞代谢提供原料，进而促进细胞的存活。DOX可能导致心肌细胞自噬长期激活，是DOX心脏毒性的机制之一，DOX可引起肌原纤维损伤和心肌萎缩，miR-212/132家族有促心肌肥大作用，Gupta等研究发现miR-212/132簇促心肌肥大作用可抑制DOX心脏毒性的心肌萎缩作用，miR-212/132簇抑制心肌细胞自噬，DOX处理大鼠心肌细胞自噬底物p62的水平下调，表明自噬激活，过表达miR-212/132抑制自噬，能够减少DOX所致p62的下降，过表达miR-212/132簇能够抑制DOX心脏毒性。Fitm2是miR-212/132下游靶基因，miR-212/132/Fitm2通路可以作为治疗DOX心脏病，Fitm2心脏中广泛表达，在脂肪组织中表达最高，Fitm2定位于内质网参与脂滴积累，过表达Fitm2能够显著抑制miR-132和miR-212的促进肥大表型。

有研究发现miR-30e能够抑制DOX诱导的心肌细胞自噬和凋亡，miR-30e是Beclin-1的调节因子，Beclin-1是一种与Bcl-2相互作用的功能蛋白，被认为是自噬的介质，ACE2（血管紧张素转换酶2）是一种在细胞外表面具有催化结构域的I型膜蛋白，具有代谢一系列血管活性肽底物的能力。ACE2可抑制DOX心脏毒性，显著改善左室收缩功能，上调MIR-30e的表达，抑制Beclin-1表达和LC3-Ⅱ/Ⅰ比值。miR-30e通过抑制3'-非翻译区活性来调节Be‐clin-1的表达，过表达miR-30e导致Beclin-1下调，抑制DOX诱导的心肌细胞凋亡，沉默miR-30e诱导的心肌细胞凋亡被ACE2过度表达所阻断，ACE2通过抑制miR-30e/Beclin-1信号通路介导的心肌细胞自噬减轻DOX心脏毒性。

3 展望

特异性miRNA作为DOX心脏毒性重要调节因子，为临床研究提供新前景。最近研究显示血液循环miRNAs谱可以反映出DOX对心脏组织的影响，传统的心肌损伤标志物如肌酸激酶（CKMB）、肌红蛋白、肌钙蛋白，灵敏性较低，特异性不高，不能及时诊断，因此开发新的标记物对弥补这些不足至关重要。还有研究发现，miRNA也会被分泌到细胞间隙中并发挥功能，大量细胞外miRNAs为以分泌分子的形式，如凋亡小体，外泌体，细胞膜微粒，存在于健康人和病人的血液中，因此miRNAs具有成为诊断DOX心脏毒性的潜能，但是关于miRNA的生物学，如分泌机制，细胞外miRNAs生物学特性目前仍不清楚，而且需要大量的标本来验证miRNAs作为DOX心脏毒性诊断和预后的生物学标记物的可靠性。miRNA药物也可以作为治疗DOX心脏毒性重要工具，miRNA药物的开发都是基于抑制基因表达的反义机制，包括miRNA模拟物和antagomirs（miRNA抑制物），这可能为新的预测、诊断、治疗策略铺平道路，以更好治疗DOX诱导的心脏毒性。