肿瘤细胞固有程序性死亡受体 1及其生物学功能研究进展△

冷光现，张有成

兰州大学第二医院普外科，兰州 730030

程序性死亡受体1（programmed cell death 1，PDCD1，也称PD-1）是CD28超家族成员之一，1992年由Ishida等成功克隆，包括免疫球蛋白样结合结构域、跨膜结构域和位于细胞质尾部的结构域，其中尾部结构域包括一个免疫受体酪氨酸抑制基序（immunoreceptor tyrosine-based inhibition motif，ITIM）和一个免疫受体酪氨酸转换基序（immunoreceptor tyrosine-based swith motif，ITSM）。PD-1不仅在CD8和CD4细胞中表达，还在调节性T细胞、B淋巴细胞、肿瘤相关巨噬细胞、自然杀伤细胞及树突状细胞等免疫细胞中表达。程序性死亡受体配体1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也称PD-L1）和PD-L2是PD-1的天然配体，可表达于多种细胞中，包括肿瘤细胞和暴露于γ干扰素（interferon-γ，IFN-γ）等细胞因子后的免疫细胞；而PD-L2主要在正常组织的树突状细胞中表达。PD-1是一种抑制性受体，与PD-L1或PD-L2结合后，其酪氨酸残基处会发生磷酸化，与蛋白酪氨酸磷酸酶SHP2作用并产生抑制信号，抑制T细胞的活化、增殖及对肿瘤细胞的杀伤活性。在肿瘤微环境中，当PD-1与表达PD-L1的肿瘤细胞接触时，免疫细胞的PD-1信号被激活，导致肿瘤细胞发生免疫逃逸从而在外周免疫耐受中发挥关键作用。既往采用抗PD-1/PD-L1通路的免疫检查点抑制剂治疗恶性肿瘤的效果显著。抗PD-1和抗PD-L1的单克隆抗体可以通过与PD-1或PD-L1竞争性结合，缓解T细胞的免疫抑制状态。抗PD-1单抗如纳武单抗、帕博利珠单抗，抗PD-L1单抗如阿特珠单抗、度伐利尤单抗、阿维单抗，均已被美国食品药品管理局（FDA）批准作为多种恶性肿瘤的临床用药。此外，另一款抗PD-1单抗——特瑞普利单抗，于2018年在中国获得了全球首个有条件批准，用于既往全身治疗失败的不可切除或转移性黑色素瘤的治疗。但只有部分患者受益于这种免疫单药治疗，除应答率低外，许多患者最终还因耐药而复发，有研究表明，抗PD-1/PD-L1抗体联合其他治疗方法可能获得更好的临床效果，但其临床疗效仍有待进一步提高。有研究表明，PD-1也可在肿瘤细胞中表达并影响肿瘤细胞的生物学行为，这些影响均不依赖于机体的适应性免疫应答。肿瘤细胞固有的PD-1是肿瘤抑制因子p53的直接靶点，p53在K120/164位点发生乙酰化并优先招募乙酰转移酶辅助因子至PD-1启动子上，通过增强局部染色质乙酰化选择性促进PD-1的转录。依据癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）和癌细胞系百科全书（Cancer Cell Line Encyclopedia，CCLE）数据库进行富集分析发现，PD-1在32种肿瘤组织中有表达，并进一步通过逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）、蛋白质印迹法和流式细胞仪证实，PD-1在包括皮肤恶性肿瘤、肝癌、胰腺癌、结肠癌、胃癌、乳腺癌、肾癌、前列腺癌等13种肿瘤的40个细胞系中表达。提示肿瘤细胞固有的PD-1可能通过不同于免疫细胞来源的PD-1的作用机制影响肿瘤的生物学行为。本文综述了近年来肿瘤细胞固有PD-1的表达及其相关作用机制的研究进展，旨在协助解释基于PD-1/PD-L1信号通路的免疫检查点抑制剂在不同肿瘤治疗中的疗效及作用机制，为开发新的免疫联合治疗方案提供重要参考。

1 肿瘤细胞固有PD-1促进肿瘤细胞增殖

1.1 通过激活雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）信号通路促进肿瘤细胞增殖

MTOR信号通路在肿瘤发生发展中发挥重要作用。既往研究认为，T细胞中的PD-1受体通过调节磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB，又称AKT）、大鼠肉瘤癌基因（rat sarcoma oncogene，RAS）、细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）、VAV和磷脂酶Cγ等通路调节细胞的生长增殖。MTOR是PI3K/AKT信号通路的下游效应分子，在基因转录水平调控细胞的存活和生长。肿瘤细胞中的MTOR信号通路被激活后，可通过改变一些关键代谢酶的表达和活性来调控肿瘤细胞的代谢。研究显示，激活MTOR可使其下游真核翻译起始因子4E结合蛋白1（eukaryotic translation initiation factor 4E binding protein 1，4EBP1）和S6K1磷酸化，磷酸化的真核起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E，elF4E）与4EBP1分离后可促进c-myc、缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）等原癌基因的转录；而磷酸化的S6K1可以继续磷酸化核糖体蛋白 S6（p-S6）、elF4B（p-elF4B）等与mRNA翻译相关的靶点。因此，免疫细胞来源的PD-1可以通过PI3K/AKT/MTOR/p-eIF4E或PI3K/AKT/MTOR/p-S6通路和级联反应促进肿瘤细胞的增殖。

Kleffel等通过流式细胞仪、免疫荧光法、RT-PCR和蛋白质印迹法检测证实，人和小鼠黑色素瘤细胞中均存在表达PD-1的亚群，该亚群产生的PD-1与PD-L1结合后可直接激活MTOR，促进了其下游的核糖体蛋白S6的磷酸化，而该磷酸化可以通过特异性的MTOR抑制剂来逆转，该研究成果于2015年发表在cell杂志上。此后，关于肿瘤细胞固有PD-1的研究逐渐扩展至肝癌、胰腺癌、肺癌等恶性肿瘤中。其中，肝癌细胞也被发现存在PD-1的固有表达，其肿瘤细胞固有的PD-1可激活MTOR通路，与下游靶分子S6和eIF4E结合并促进其磷酸化，从而促进肿瘤进展。黑色素瘤及肝癌细胞中固有PD-1均可通过直接激活MTOR及其下游通路发挥作用，提示PD-1受体不依赖于经典的PI3K/AKT/MTOR信号通路，这可为新的联合免疫方案提供思路，目前相关的研究正在进行。有体外实验采用MTOR抑制剂——INK128与抗PD-1单抗联合处理免疫缺陷的肝癌小鼠及肝癌细胞系，结果显示，联合用药能更有效地促进肿瘤消退并抑制肝癌细胞的生长，而单药的疗效并不显著。

1.2 通过Hippo通路促进肿瘤细胞增殖

肿瘤的发生发展涉及多种信号通路的调控。其中Hippo信号通路不仅在组织生长发育和内环境稳态中发挥重要作用，同时也可调控肿瘤的发生发展过程。当Hippo通路被激活时，通过MST1/2、Sav、LATS1/2、MOB1等级联反应最终使下游效应分子YAP/TAZ磷酸化，留滞于细胞质中被降解或灭活。与此相反，非磷酸化的YAP/TAZ易位至细胞核，通过与转录因子TEA结构域家族成员（TEA domain family member，TEAD）结合，诱导靶基因的表达。Yao等通过对TCGA的回顾性分析发现，胰腺导管腺癌中存在肿瘤固有PD-1 mRNA的表达。另有研究显示，胰腺癌细胞中固有的PD-1可抑制单极纺锤体-结合蛋白1（Mps one binder 1，MOB1）的磷酸化，导致LATS1失活，从而抑制YAP的磷酸化而避免被清除，非磷酸化的YAP蛋白易位入细胞核与TEDA结合后，激活Hippo通路下游富含半胱氨酸蛋白61（cysteinerich 61，Cyr61）、结缔组织生长因子（connective tissue growth factor，CTGF）等基因促进肿瘤细胞的增殖。与黑色素瘤及肝癌细胞中固有的PD-1相似，该生物学过程不依赖于适应性免疫，Hippo通路抑制剂联合抗PD-1单抗治疗胰腺癌，二者间发挥了更强的协同抗肿瘤作用。由此可见，基于肿瘤细胞固有PD-1特定的作用机制制订个体化的联合免疫治疗方案可能是未来研究的方向。

2 肿瘤细胞固有PD-1抑制肿瘤细胞增殖

PI3K/AKT及促分裂原活化的蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）/ERK1/2信号通路的激活是促进肿瘤细胞增殖的两条关键通路。磷酸化AKT（p-AKT）是激活PI3K/AKT信号通路的关键分子，在肿瘤的发生发展中发挥关键作用。磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）可以转移至细胞核，调节转录因子的活性，最终改变细胞的代谢和功能，参与恶性肿瘤细胞的形成。在非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）细胞中也可检测到固有PD-1的表达，然而与黑色素瘤和肝细胞癌不同，NSCLC固有PD-1通过抑制p-AKT及p-ERK1/2从而抑制AKT和ERK1/2的激活，最终抑制肿瘤的发生发展。另有研究报道，1例表达肿瘤固有PD-1的NSCLC患者接受抗PD-1治疗2个月后，肿瘤进展迅速；同样，在小鼠NSCLC细胞系M109中也检测到固有PD-1的表达，并与PD-L1的表达呈负相关，PD-1过表达显著降低了细胞增殖能力，而PD-1敲除后细胞活力增加；推测这可能是由于在NSCLC细胞中与PD-1结合的磷酸酶不同于黑色素瘤细胞中固有PD-1结合的磷酸酶结果。

一项研究报道显示，PD-1在黑色素瘤细胞中表达为假阳性，Metzger等通过流式细胞仪证实，黑色素瘤细胞中表达的PD-1是凋亡细胞的核抗原与抗PD-1单抗发生交叉反应从而误导了结果的判定。提示上皮肿瘤细胞可能并没有真正存在PD-1的表达，但相关结论仍需要进一步证实。无论怎样，关于肿瘤细胞固有PD-1的研究是一个很有吸引力的话题。

3 小结与展望

虽然目前相关研究已经很好地描述了PD-1在免疫细胞中的作用，但PD-1在肿瘤细胞中的固有表达及其潜在作用机制尚不明确，阐明细胞内固有PD-1在不同肿瘤中调控机制非常必要。PD-1在不同肿瘤细胞mRNA和蛋白水平上表达，并在不同类型的肿瘤细胞发挥不同的生物学作用，提示PD-1在肿瘤细胞中可能发挥了不同于在免疫细胞中的作用，这将有助于理解目前免疫检查点抑制剂对肿瘤治疗效果有限的可能原因。虽然越来越多的研究旨在阐明肿瘤固有PD-1表达在肿瘤细胞中的作用及其临床意义，但对它的了解仍然有限。因此，未来对肿瘤固有PD-1的深入研究可能为进一步提高免疫检查点阻断疗法的疗效提供更多理论依据，并有利于开发更有效的联合免疫治疗方案。