白芍内生菌与成分、活性相关性研究进展
2021-11-11谢若男杨满琴刘劲松王国凯韩明辰黄宇飞
张 楠，谢若男，杨满琴，刘劲松，王国凯，韩明辰，黄宇飞
(1.安徽中医药大学第二附属医院，安徽 合肥 230061；2. 安徽中医药大学药学院，安徽 合肥 230012)
白芍为毛茛科植物芍药Paeonia
lactiflora
Pall.的干燥根，其味苦、酸，微寒，归肝、脾经，具有养血调经、敛阴止汗、柔肝止痛、平抑肝阳的功效。白芍的主要活性成分包括单萜及其苷类、三萜类和黄酮类等，具有调节免疫、镇痛、抗炎、抗肿瘤以及保肝等多种药理作用，临床常用于调节免疫功能，治疗风湿免疫性疾病。植物内生菌是一类存活于健康植物组织内部，却不引起宿主植物表现出明显病症的微生物，包括内生真菌、内生细菌和内生放线菌。内生菌与宿主植物长期互利共生的同时，自身能产生许多生物活性代谢产物，甚至能产生与宿主植物相同或相似的活性产物以及新的活性产物；还能诱导和促进宿主植物活性成分的合成和积累。因此，植物内生菌的研究为天然活性产物的发现和新药的研发带来了新方向，具有很好的开发以及应用前景。然而，目前，白芍的研究多集中在化学成分以及药理作用等方面，关于其内生菌的研究尚处于起步阶段，还有待进一步探索与开发。现对白芍中内生菌的多样性、生物活性以及次生代谢产物研究进行综述，阐明白芍内生菌与成分、活性之间的相关性，并提出现阶段研究中存在的相关问题以及解决方案，以期为白芍内生菌进一步开发与利用提供参考。
1 白芍内生菌多样性及生物活性研究
植物内生菌分布广泛且具有丰富的物种、生态和遗传多样性，表现在从不同组织部位、不同生长年限或不同生长环境植物中分离得到的内生菌种类、数量以及优势种属等方面均具有差异性。
1.1 内生真菌多样性及生物活性研究 马宗慧等从亳芍根茎部位分离鉴定出24株内生真菌，隶属于9属13种，分别为镰刀菌属(Fusarium
)、篮状菌属(Talaromyces
)、指形菌属(Dactylonectria
)、粘头菌属(Myxocephala
)、Llyonectria
、青霉属(Penicillium
)、交链孢霉属(Alternaria
)、重组尾孢霉属(Rhexocercosporidium
)和Lopadostoma
，优势种群为镰刀菌属(Fusarium
)，占总数的33%。程孝中等从亳芍根、茎、叶3个部位共分离纯化得到101株内生真菌，至少归属为8属16种，其中优势种属为曲霉属(Aspergillus
)、交链孢霉属(Alternaria
)和青霉属(Penicillium
)。另外，叶片中分离出的内生真菌多于从根和茎中分离出的内生真菌；茎叶之间内生菌的相似性指数(0.733)最高，其次是根和叶(0.615)，茎和根(0.563)。杨瑞先等从洛阳芍药根部分离得到52株内生真菌，结合形态学和ITS序列分析鉴定其分布于7目、13科、15属，其中优势种群分别为小球腔菌属(Leptosphaeria
)、土赤壳属(Ilyonectria
)和镰刀菌属(Fusarium
) 3种。李园园等分别用改良的GYM培养基、TWYE培养基对白芍内生菌进行分离鉴定以及抗菌活性和抗肿瘤活性测定，结果发现，GYM培养基明显比TWYE培养基分离效果好。活性测试结果显示，部分白芍内生菌发酵产物对耐药大肠杆菌(Escherichia
coli
)和藤黄微球菌(Micrococcus
luteus
)具有一定的抑制能力，对抗肿瘤模型的稻瘟霉孢子萌发具有一定的抑制作用。1.2 内生细菌多样性及生物活性研究 研究者从新疆块根芍药中分离鉴定出11株内生细菌XJU-PA-1—XJU-PA-11，其中XJU-PA-1、XJU-PA-5、XJU-PA-6、XJU-PA-9和XJUPA-10对植物致病菌抑制作用较强；菌株XJU-PA-1、XJU-PA-6分别被鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus
subtilis
)、粘质沙雷氏菌(Serratia
marcescens
)，其中枯草芽孢杆菌对玉米小斑病菌(Bipolaris
maydis
)和苹果斑点落叶病菌(Alternaria
mali
)的抑制能力较强，粘质沙雷氏菌对多种植物致病菌均显示出很强的抑制作用。杨瑞先等从洛阳芍药根部分离出48株内生细菌，分布于5属14种，分别为泛菌属(Pantoea
)、肠杆菌属(Enterobacter
)、氨醇杆菌属(Sphingobacterium
)、芽孢杆菌属(Bacillus
)及假单胞杆菌属(Pseudomonas
)，其优势种群主要为芽孢杆菌属及假单胞杆菌属细菌，表明芍药根部的内生细菌资源种类丰富多样且具有地域差异。1.3 内生放线菌多样性及生物活性研究 放线菌是指能够产生抗生素以及其他多种活性产物的微生物，广泛存在于药用植物中。张秀敏等分别采用S、SCA、FYSCA 3种分离培养基从河北产地的白芍根部共分离得到16株内生放线菌，其中从FYSCA培养基中分离到的内生放线菌菌株最多，表明该培养基相对其他两种更适合白芍内生放线菌的分离培养。另外，16株内生放线菌中有6株对农作物致病菌和人类常见病原菌具有抑制作用，其中菌株S-BS033004被鉴定为链霉菌(Streptomyces
)，其对棉花黄萎病菌(Verticillium
dahliae
)、小孢拟盘多毛孢菌(Pestalotiopsis
microspora
)和耐青霉素类(Penicillin
)金黄色葡萄球菌(Staphyloccocus
aureus
)具有显著的抑菌作用。白芍内生菌多样性研究不仅丰富了白芍内生菌种类资源，而且为开展白芍内生菌次生代谢产物的分离鉴定、活性检测及其机制方面的研究奠定了坚实的基础，更为后续深入研究白芍内生菌资源以及新型活性化合物的发现提供有力的实验基础和科学依据。
白芍内生菌生物活性研究结果表明，白芍内生菌具有抗植物病原菌以及人类病原菌的能力，还具有潜在的抗肿瘤作用。内生菌的抗植物病原菌作用可以有效协助宿主植物对抗外来病原菌，这类内生菌可以用于生物菌剂的开发，在防治植物病虫害方面具有巨大的应用前景；对人体病原菌显示出抗菌活性的菌株，为新型抗生素的研究与开发提供了有价值的资源；菌株的抗肿瘤作用为研发新型抗肿瘤活性药物提供了新的方向。内生菌生物活性的形成实则是与内生菌中某些次生代谢产物有关，如粘质沙雷氏菌产生的代谢物灵菌红素(Prodigiosin, PG)，具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、抗肿瘤和免疫抑制等多种生物学活性。白芍内生菌次生代谢产物生物活性的作用机制还有待探讨，今后可以对其进行更深层次的研究以满足相关应用的需要。
2 白芍内生菌次生代谢产物研究
内生菌次生代谢产物类型多、活性广、易规模化生产，是发现新的具有生物活性化合物以及先导化合物的重要来源。因此，内生菌次生代谢产物的研究日益成为天然药物化学研究者关注的热点之一。目前，研究者从两株亳芍内生真菌乙酸乙酯提取物中共分离鉴定出42种单体化合物，其中包括13个新化合物，结构类型包含混源萜类、苯并-a
-吡喃酮衍生物、苯并-c
-吡喃酮衍生物、酰胺型、苯环衍生物等。王举涛等从白芍优势内生真菌Penicillium
mariae
-crucis
发酵液的乙酸乙酯部位共分离鉴定出10个化合物，分别为penicmariae
-crucis
A (1)、penicmariae
-crucis
B (2)、penicmariae
-crucis
C (3)、penicmariae
-crucis
D (4)、(E
)-2-甲基己-3-烯二酸(5)、2-乙酰基-3-羟基-5-甲氧基苯乙酸(6)、2-乙酰基-3-羟基-5-甲氧基苯乙酸甲酯(7)、2-乙酰基-3,5-二羟基苯乙酸甲酯(8)、β
-谷甾醇(9)、过氧化麦角甾醇(10)；其中化合物1—4为新化合物，化合物5为新天然产物。王举涛等还从亳芍优势内生真菌菌株Alternaria
alternate
发酵液的乙酸乙酯部位共分离鉴定出32个化合物，分别为tricycloalternarenes (TCAs) 15b(1)、TCAs 16b(2)、TCAs 17b(3)、TCAs 18b(4)、alternate A(5)、alternate B(6)、alternate C(7)、alternate D(8)、alteamide(9)、TCAs 5(10)、TCAs 6(11)、TCAs 7(12)、TCAs 8(13)、djalonensone(14)、3-hydroxyalternariol 5-O
-methylether(15)、altenuisol(16)、1-deoxyrubralactone(17)、methyl 4-acetamido-3-hydroxybenzoate(18)、(E
)-methyl-5-hydroxy-3-methylpent-2-eno(19)、异苯并呋喃酮A(20)、对羟基苯乙酮(21)、6-hydroxy-isosclerone(22)、talaroflavone(23)、7-hydroxy-2-hydroxymethyl-5-methyl-4H
-chromen-4-one(24)、altenarienonic acid(25)、7-hydroxy-2,5-dimethy-4H
-1-benzopyran-4-one(26)、5-hydroxy-epialtenuene(27)、交链孢醇(28)、methyl 3-hydroxybenzoate(29)、stemphyperylenol(30)、细格菌素(31)、交链孢烯(32)；其中化合物1—9为新化合物，化合物7对MDA-MB-231、MCF-7两种肿瘤细胞株的半数抑制浓度分别为20.1、 32.2 μmol/L，具有一定的抗肿瘤活性。目前，白芍内生菌次级代谢产物研究主要围绕内生真菌展开，对于内生细菌和内生放线菌研究的相对较少。今后可加强内生菌次生代谢产物的分离鉴定与活性筛选方面的研究，丰富代谢物种类的同时，有望发现更多具有生物活性的代谢产物。
3 白芍内生菌与成分、活性相关性研究
植物内生菌与成分、活性之间的相关性主要体现在内生菌可以影响活性成分的生成和积累，一是内生菌自身能够产生活性成分，二是内生菌能够促进宿主植物产生活性成分。
3.1 内生菌自身能产生活性成分 内生菌从寄主植物中汲取营养并通过一系列新陈代谢等生命活动产生次生代谢产物，这些代谢产物具有许多生物活性，不仅具有与宿主植物相同或相似的生物活性，而且还具有许多新的生物活性。1993年，Stierle等从短叶紫杉中分离出产紫杉醇的植物内生真菌，这说明植物内生菌具有产生与宿主植物相同或相似活性化合物的能力，因此从植物内生菌中寻找生物活性化合物成为一大研究热点。程孝中等从亳芍内生真菌中筛选出4株产芍药苷的内生真菌，分别为细极链格孢菌(Alternaria
tenuissima
)、黄曲霉菌(Aspergillus
flavus
)、普通青霉菌(Penicillium
commune
)和棒束孢属(Isaria
)细脚棒束孢种(Isaria
tenuipes
)。其中菌株黄曲霉菌(Aspergillus
flavus
)产芍药苷的产量达到342.4 μg/L，可作为规模化生产芍药苷的候选菌株。3.2 内生菌能促进宿主植物产生活性成分 研究表明，植物内生菌不仅自身能合成宿主植物活性成分，而且还能诱导和促进宿主植物活性成分的合成与积累，说明植物内生菌有望成为促进药用植物产生活性成分的刺激源。但是，目前尚无关于白芍内生菌促进宿主植物产生活性成分的相关研究，后续可以围绕该方向进行相应的研究与探讨。
4 白芍内生菌相关研究中存在的问题及展望
白芍中内生菌种类与资源丰富多样。目前，白芍内生菌的研究主要集中在内生菌分离鉴定、生物活性以及次生代谢产物方面。内生菌菌株的生物活性主要是其具有抑制植物或人类病原菌的作用。内生菌菌株的抑菌作用为增强植物的抗病性、抵抗不良环境能力以及筛选新的活性成分提供有力依据。另外，从内生菌中筛选出与宿主植物相同的活性成分，为规模化生产创造了良好的条件，能有效地缩短生产时间以及节约成本，还可拓宽天然药物发现的途径，具有广阔的开发以及应用前景。
然而，白芍内生菌研究与应用方面仍然有许多需要解决的问题。首先，目前白芍内生菌的研究重点在于内生菌的抗菌作用，而其他活性研究相对较少，同时对抗菌活性较好的菌株未进行深入地挖掘。因此，未来研究方向可着眼于内生菌其他生物活性的筛选，丰富白芍内生菌的生物功能，还可以对具有抗菌活性及其他生物学活性的内生菌代谢产物进行深入研究，对代谢产物进行分离鉴定与活性筛选，为新药研发以及先导化合物的发现等奠定良好的基础。其次，对于产生白芍活性成分的内生菌菌株，可以进行发酵条件的优化，加强机制和育种方面的研究，以达到培养高产菌株的目的。最后，由于产地、采收期以及宿主植物生长年限等的差异使得白芍内生菌种类与资源更加丰富多样，因此在后续的研究中可以分别对不同地域、不同采收期或者不同生长年限的白芍内生菌进行多样性对比研究，在丰富白芍内生菌种类与资源的同时，进一步阐明内生菌在道地药材次生代谢产物研究中的作用，并揭示内生菌影响中药材品质的机制。
