一种多氯联苯胶体金免疫快速检测试纸条的研制

万宇平，郑百芹，贾芳芳，李爱军，崔海峰，贾招闪，何方洋2，

（1.北京勤邦生物技术有限公司，北京 102206；2.北京市食品安全免疫快速检测工程技术研究中心，北京 102206；3.唐山市食品药品综合检验检测中心，河北 唐山 063000；4.滦州市农业农村局，河北 滦州 063799）

多氯联苯（polychlorinated biphenyls，PCBs）属于卤代芳烃类化合物，可作为树脂、防火剂、涂料等多种工业品的添加剂[1-2]，是一种用途很广的工业化学品。而该物质属于致癌物，容易在人体的脂肪组织中积累，对神经系统、生殖系统、免疫系统均有危害作用；同时对水体和大气环境均可造成污染[1-2]。虽然大多数国家已停止了生产和使用多氯联苯，但其物理化学性质非常稳定，会长期存在于地球的生态系统中[3]。在PCBs的209种同系物中，多氯联苯PCB118是毒性较强的一种。因此，检测PCB118残留量是必要的[4]。

目前，检测多氯联苯的方法有气相色谱法、气相色谱-串联质谱法、光电化学传感器法等。其中，蓝梦哲[5]建立了鱼粉饲料中多氯联苯残留量的气相色谱分析方法，对7种指示性多氯联苯（PCBs）在3个添加水平的平均回收率（n=5）为83.1%～109.4%，相对标准偏差为0.70%～7.28%。陈丽金[6]建立了测定饲料中多氯联苯残留量的气相色谱析方法，测定结果显示，18种多氯联苯的检出限为0.004～0.010 mg/kg。张桃英等[7]建立了使用快速溶剂萃取（accelerated solvent extraction，ASE）技术提取，毛细管柱为分离柱，以电子捕获检测器检测，用气相色谱法同时测定果蔬中15种有机氯农药的残留量，最低检出限为1.1～20 μg/kg。王文兰等[8]建立了一种气相色谱内标标准曲线法测定鱼肉中7种指示性多氯联苯不确定度的分析方法。时磊等[9]用气相色谱法测定了稻谷中18种有机氯农药和7种多氯联苯的含量。侯圣军等[10]建立了大米中12种有机氯农药气相色谱-电子捕获检测器检测方法。杜静等[11-14]也应用了气相色谱法测定多氯联苯残留量。何芳等[15]为监测小麦中多氯联苯污染状况，应用超声波提取、分散固相萃取净化、气相色谱-质谱法（gas chromatography-massspectrometer，GC-MS）检测，建立了一种简单、快速测定小麦中7种指示性多氯联苯（PCB28、PCB52、PCB101、PCB118、PCB153、PCB138、PCB180）的分析方法。王定森等[16]研究了Aroclor系列多氯联苯的组成特点，提出了选取各Aroclor系列多氯联苯中5～10个特征峰，将选取的特征峰面积加和与浓度制作标准曲线进行定量的方法，作为标准方法的补充说明。杨代凤等[17]建立了气相色谱-质谱法同时快速测定小麦中12种二噁英类多氯联苯（dioxin-like polychlorinated biphenyls，DL-PCBs）的分析方法。朱芸等[18]建立了加速溶剂萃取-气相色谱质谱法同时测定34种有机氯农药（organochlorine pesticides，OCPs）和18种多氯联苯类化合物（PCBs）的方法。杨梅[19]研究了固相萃取-气相色谱串级质谱联用方法测定食品中多氯联苯的方法。宋梓亮等[20]建立了饲料中多氯联苯Aroclor 1242系列的气相色谱-质谱联用分析方法。潘娟等[21-23]同样应用了气相色谱-质谱法对多氯联苯残留量进行了测定。王贵珍[24]以单个多氯联苯的适配体为识别元件，将适配体修饰于不同的纳米材料上，构建不同的电化学和光电化学适配体传感器实现对多氯联苯（PCBs）单体PCB77和PCB72的测定。

与上述方法相比，免疫化学检测法对药物检测具有快速、特异、灵敏、准确、可以批量监测、样品处理简单、能实现自动化操作等优点[25-26]。而免疫化学法检测多氯联苯的前提是具备抗多氯联苯的抗体，本研究制备出一种多氯联苯单克隆抗体，并应用于胶体金免疫层析试纸条，费用及检测时限均能够满足基层实验室的检测需求，该产品已市场化，具有实际应用价值。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

多氯联苯PCB118、PCB52、PCB101、PCB28、PCB138、PCB153、PCB180等标准品（纯度≥95%）：北京标准物质研究中心。

1.2 仪器与设备

GT-700胶体金分析仪：北京勤邦生物技术有限公司；HFJ-10均质器、MX-F涡旋仪：湖南湘立科学仪器有限公司；JA2003电子天平：上海力辰仪器科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 多氯联苯半抗原的制备

取多氯联苯PCB118326mg，加N，N-二甲基甲酰胺20mL溶解，充分搅拌，加入氢氧化钾0.56 g，加入50%乙醛酸水溶液0.51 mL，加热至90 ℃，反应8 h，停止反应，加1 mol/L盐酸，调节pH值至6，加水60 mL，加1,2-二氯乙烷100 mL萃取，静置分层，分去水相，有机相水洗，干燥，蒸干，上硅胶柱，二氯甲烷/甲醇（10/1，V/V）洗脱分离，得到羧基多氯联苯PCB118 0.24 g，回收率60%。氯联苯半抗原合成途径如下：

1.3.2 免疫原的制备

取羧基多氯联苯15 mg，加二甲基甲酰胺1 mL溶解，加1-羟基苯并三唑11.4 mg，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺14 mg，室温反应3 h，得到半抗原溶液A液；取牛血清白蛋白50 mg，加0.05 mol/L碳酸盐缓冲液溶解，得到B液，将A液滴加到B液中，4 ℃反应12 h，0.02 mol/L磷酸盐缓冲液透析纯化3 d，每天换液3次，得到多氯联苯-牛血清白蛋白偶联物，即为免疫原，-20 ℃保存，备用。

1.3.3 包被原的制备

取羧基多氯联苯9 mg，加二甲基亚砜1 mL溶解，加N-羟基琥珀酰亚胺7.9 mg，1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亚胺8.4 mg，室温反应3 h，得到半抗原溶液A液；取卵清蛋白50 mg，后续步骤同1.3.2，得到包被原。

1.3.4 微孔试剂的制备

取0.01%氯金酸水溶液100 mL加热至沸腾；一边搅拌，一边准确加入1%柠檬酸三钠溶液1.5 mL；待氯金酸水溶液变为酒红色，继续煮沸15 min，冷却后，4 ℃避光保存。在磁力搅拌作用下，用0.2 mol/L Na2CO3溶液调节胶体金溶液的pH值至7.2，加入60 μg多氯联苯单克隆抗体/mL胶体金溶液，混匀，静置10 min，加入10%牛血清蛋白（bovine serum albumin，BSA），使其在胶体金溶液中的体积分数为1%，静置10 min。离心、洗涤、重悬，4 ℃保存备用。

试纸条的检测线T线包被有1.3.3制备的包被原，包被量为1.0 μg/cm2；质控线C线包被有羊抗鼠抗抗体，包被量为1.0 μg/cm2。

将100 μL多氯联苯单克隆抗体-胶体金标记物加入微孔板中，置于冷冻干燥机，冷阱温度为-50 ℃，预冻3 h，再真空干燥15 h，得到微孔试剂。

1.3.5 样本前处理方法

用均质器均质饲料样本；称取（5.0±0.05）g均质后的饲料样本至50 mL聚苯乙烯离心管中，加入25 mL体积分数50%甲醇，用振荡器剧烈振荡5 min，室温条件下3 000×g离心5min；移取500μL上清液至2 mL聚苯乙烯离心管中，加入500 μL10%氯化钠水溶液，用振荡器振荡1 min，混匀；待用。

1.3.6 检测方法

向微孔中加入100 mL待测样本，孵育3 min，吸取70 mL滴至试纸条上，反应10 min，判读检测结果，见图1。

图1 多氯联苯胶体金试纸条结果判定示意图Fig.1 Schematic diagram of polychlorinated biphenyl test strip result determination

1.3.7 试纸条检测限的测定

在空白饲料样本（豆粕、牛浓缩饲料、猪浓缩饲料、猪配合饲料、鸡配合饲料、鱼饲料、玉米胚芽饼）中分别添加多氯联苯标准品，质量浓度为0、6 μg/L、8 μg/L、10 μg/L、12 μg/L、14 μg/L，按照1.3.6检测三批试纸条，每个浓度重复5次，根据实验结果确定样本检测限[25-26]。

1.3.8 试纸条特异性的测定

分别配制100 μg/L的PCB52、PCB101、PCB28、PCB138、PCB153、PCB180等药物，用试纸条重复检测3次，检测试纸条的特异性。

1.3.9 试纸条准确性的测定

试纸条的准确性通常以假阳性率和假阴性率表示，假阳性率应小于5%，假阴性率应为0。用试纸条检测样品中是否残留多氯联苯，通过仪器确证的50份阴性饲料样品（质量浓度＜10 μg/kg）和50份阳性饲料样品（质量浓度＞10 μg/kg），计算假阳性率和假阴性率。

1.3.10 试纸条稳定性的测定

用试纸条检测20份阴性饲料样品（质量浓度＜10μg/kg）和20份阳性饲料样品（质量浓度＞10 μg/kg），上述样品均经过仪器确证，试纸条于2～8 ℃冷藏保存，保存时间分别为1个月、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、7个月、8个月、9个月、10个月、11个月、12个月、13个月，每个样品重复测定2次，判定试纸条的稳定性。

2 结果与分析

2.1 样本检测限

分别配制多氯联苯质量浓度为0、6μg/L、8μg/L、10μg/L、12 μg/L、14 μg/L的豆粕、牛浓缩饲料、猪浓缩饲料、猪配合饲料、鸡配合饲料、鱼饲料、玉米胚芽饼等饲料样品，按照

1.3.6 步骤进行检测，确定检测限[25-26]，试验结果见表1。结果表明，当饲料样品中多氯联苯质量浓度为0、6 μg/L、8 μg/L时，试纸条显示阴性，即未能检测到样品中含有多氯联苯；当饲料样品中多氯联苯质量浓度≥10 μg/L时，试纸条显示阳性，即能够检测到样品中含有多氯联苯，则该试纸条的检测限定为10 μg/kg。

表1 多氯联苯快速检测试纸条的检测限Table 1 Detection limit of the polychlorinated biphenyl test strip for rapid detection

2.2 特异性测定结果

该试纸条检测100 μg/L 的PCB52、PCB101、PCB28、PCB138、PCB153、PCB180等药物的特异性测定结果见表2。结果表明，检测结果均呈阴性，即该试纸条与上述药物无交叉反应，特异性较好。

表2 特异性测定结果Table 2 Result of specificity tests

2.3 准确性测定结果

用试纸条检测50份阴性和50份阳性豆粕、牛浓缩饲料、猪浓缩饲料、猪配合饲料、鸡配合饲料、鱼饲料、玉米胚芽饼等饲料样品，检测结果见表3。结果表明，未出现假阳性和假阴性，即试纸条准确性较高。

表3 准确性测定结果Table 3 Result of accuracy tests

续表

2.4 稳定性测定结果

针对豆粕、牛浓缩饲料、猪浓缩饲料、猪配合饲料、鸡配合饲料、鱼饲料、玉米胚芽饼等饲料样本，试纸条进行了假阳性率和假阴性率的测试，结果见表4。

表4 稳定性测定结果Table 4 Result of stability tests

结果表明，12个月内，稳定性指标均符合要求，说明稳定性能够维持12个月。从第13个月起，试纸条会出现少量失效、假阳性等现象，即超过12个月，试纸条质量已不稳定。

3 结论

本研究制备出多氯联苯半抗原，使之与牛血清白蛋白/卵清蛋白偶联，分别得到多氯联苯免疫原和多氯联苯包被原，从而制备出多氯联苯胶体金免疫层析试纸条。测定了多氯联苯胶体金试纸条的产品检测限，并对其特异性、准确性和稳定性等指标进行了测试，均符合《农残办技术材料要求及审查程序》要求。另外，多氯联苯胶体金试纸条的检测限为10 μg/kg，检测时间仅为15 min，灵敏度高且用时短，即具有免疫快速检测产品的特点。